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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教关于构建克隆进行小RNA表达的问题
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runhuahan

铜虫 (小有名气)

[求助] 请教关于构建克隆进行小RNA表达的问题

最近小弟在做构建克隆进行小RNA表达的实验，但是有几个问题想请教一下各位
1、如果我不知道sRNA的确切序列，只是尽量把这个sRNA连在载体上，也就是这个sRNA前后也有一些多余的序列一起连在表达质粒上，可不可行？
2、sRNA是单链的，连在载体上时是否有方向性，怎样确定这个方向性？
多谢各位了！！！！
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1楼 2012-12-07 09:44:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 有多余的序列不一定可以。主要看小RNA的二级结构，是否能与目的mRNA形成正确的杂合分子。
2. 连接当然有方向性。你需要给小RNA加一个强启动子或者可调控的，然后正向连入小RNA序列就是表达小RNA，连入reverse complement序列的话就是anti-sense了。
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2楼2012-12-07 13:16:08
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runhuahan

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-07 13:16:08
1. 有多余的序列不一定可以。主要看小RNA的二级结构，是否能与目的mRNA形成正确的杂合分子。
2. 连接当然有方向性。你需要给小RNA加一个强启动子或者可调控的，然后正向连入小RNA序列就是表达小RNA，连入reverse c ...

谢谢你，但你说正向连入小RNA序列是表达小RNA，不是应该把编码小RNA的序列，也就是他的reverse complement序列连入，这样才能表达目的sRNA吧？
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3楼2012-12-11 14:43:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by runhuahan at 2012-12-11 14:43:12
谢谢你，但你说正向连入小RNA序列是表达小RNA，不是应该把编码小RNA的序列，也就是他的reverse complement序列连入，这样才能表达目的sRNA吧？...

表达的序列是和你连入的序列一致的。转录时是以互补链为模板的。所以考虑一个基因的表达的RNA序列是和基因序列一致的，只是把T换成U。
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4楼2012-12-11 14:51:03
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runhuahan

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-11 14:51:03
表达的序列是和你连入的序列一致的。转录时是以互补链为模板的。所以考虑一个基因的表达的RNA序列是和基因序列一致的，只是把T换成U。...

再次谢谢您，也就说我要表达哪个小RNA，就把它的序列连在表达载体上就行了，对吧
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5楼2012-12-11 22:24:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by runhuahan at 2012-12-11 22:24:13
再次谢谢您，也就说我要表达哪个小RNA，就把它的序列连在表达载体上就行了，对吧...

是的，把与RNA序列相同的对应DNA序列连在载体上就可以了。
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6楼2012-12-12 07:48:28
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

请问楼主用的是什么载体呢？
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keepon
7楼2012-12-12 09:12:01
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runhuahan

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-12-12 09:12:01
请问楼主用的是什么载体呢？

pNM12或者pTRC99a，你有什么推荐的表达载体么？
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8楼2012-12-12 10:15:48
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by runhuahan at 2012-12-12 10:15:48
pNM12或者pTRC99a，你有什么推荐的表达载体么？...

我们一般用的是PCDNA3.1，但是楼主这个是表达sRNA，我不太懂哎。。。嘿嘿。。。
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keepon
9楼2012-12-13 09:17:45
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