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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】拟南芥保卫细胞原生质体RNA提取电泳图，出现反向弥散？
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sunny_0211

银虫 (初入文坛)

[求助] 【求助/交流】拟南芥保卫细胞原生质体RNA提取电泳图，出现反向弥散？ 已有1人参与

我需要先对拟南芥保卫细胞提取原生质体，需要大概5小时左右，然后加入Trozol试剂，氯仿去蛋白，异丙醇沉淀，测RNA含量在4000ng/ul左右，但是甲醛变型胶电泳无条带，或是出现5S条带。
    请问是RNA降解了吗？还是我就没提取出来？前期的酶解提取原生质体过程较长。对后续提取RNA是否产生了影响？
    本人计划提取RNA用于文库构建，一直不能解决RNA提取的问题，十分着急，希望做过这方面实验的同学、老师、专家能够给予宝贵意见，不胜感激
  
PS：有时候点样孔反向出现弥散状条带，于是反向电泳出现一条亮带，这是什么情况？

FX-RNA_副本.jpg



RNA1_副本.jpg



RNA25min.jpg
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1楼 2012-11-30 13:24:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sunny_0211: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢您 2012-12-09 23:53:27
样品处理时间过长对RNA肯定有影响。如果非要处理的话，能否在处理过成中加蛋白酶K抑制核酸酶？
此外，你的样品是否做了DNA消化？感觉杂质多。反向电泳条带可能也说明有其他杂质结合核酸，带正点，所以往反向跑了。
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2楼2012-12-01 09:09:03
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sunny_0211: 金币+2, ★有帮助, 谢谢您 2012-12-09 23:57:29
你这处理了五个小时，再牛的RNA也降解了……
还是老老实实液氮研磨之后用Trizol融比较好
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3楼2012-12-01 13:22:31
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sunny_0211

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-01 09:09:03
样品处理时间过长对RNA肯定有影响。如果非要处理的话，能否在处理过成中加蛋白酶K抑制核酸酶？
此外，你的样品是否做了DNA消化？感觉杂质多。反向电泳条带可能也说明有其他杂质结合核酸，带正点，所以往反向跑了。

你好 谢谢您的意见  样品没有经过DNA消化 杂质较多 我也怀疑是杂质结合了核酸 至于处理时间的问题 我参照了拟南芥原生质体转化的方法，其中在提取出原生质体后还要进行约16小时的转化，使目的蛋白表达观察荧光，进行定位，所以，估计不是由于前期处理时间过长造成的。万分感谢您 十分抱歉我回复晚了（生病了） 谢谢您
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4楼2012-12-09 23:52:49
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sunny_0211

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-12-01 13:22:31
你这处理了五个小时，再牛的RNA也降解了……
还是老老实实液氮研磨之后用Trizol融比较好

首先谢谢您的意见 我参考了拟南芥原生质体转化的方法，在4-5小时酶解处理后，还要转入连接有目的蛋白的载体，进过约16小时的表达，观察荧光。估计前期处理的影响不太大。十分感谢您的帮助，抱歉我回复晚了（生病了） 谢谢
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5楼2012-12-09 23:56:56
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麦戈桑默

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我提取的也总是降解， 所用的器皿也用DEPC水泡过，过程如下：收菌以后用生工家的trizol悬浮菌体，液氮研磨，每1mltrizol 0.2ml氯仿的量加入氯仿，手摇混匀2min,在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g4℃离心10分钟。取上层水相置于新EP管中，加等体积l异丙醇。放置20分钟，12000g4℃离心10分钟。        弃上清，按照每管加1ml 75%乙醇进行洗涤，12000g4℃离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
用DEPC熏蒸过的水溶解RNA沉淀。

我的电泳槽也用DEPC水泡过
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6楼2013-04-24 10:43:57
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落叶的轨迹

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

最近也要开始提保卫细胞原生质体了，所以才开始关注这方面的帖子，刚刚看到你的提问了，也不知能否联系到你，
实验方面刚刚开始就遇到了很多问题，希望可以和过来人交流一下，盼望回复
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7楼2015-07-23 11:05:03
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