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sunny_0211

银虫 (初入文坛)

[求助] 【求助/交流】拟南芥保卫细胞原生质体RNA提取电泳图,出现反向弥散? 已有1人参与

我需要先对拟南芥保卫细胞提取原生质体,需要大概5小时左右,然后加入Trozol试剂,氯仿去蛋白,异丙醇沉淀,测RNA含量在4000ng/ul左右,但是甲醛变型胶电泳无条带,或是出现5S条带。
    请问是RNA降解了吗?还是我就没提取出来?前期的酶解提取原生质体过程较长。对后续提取RNA是否产生了影响?
    本人计划提取RNA用于文库构建,一直不能解决RNA提取的问题,十分着急,希望做过这方面实验的同学、老师、专家能够给予宝贵意见,不胜感激
  
PS:有时候点样孔反向出现弥散状条带,于是反向电泳出现一条亮带,这是什么情况?

FX-RNA_副本.jpg



RNA1_副本.jpg



RNA25min.jpg
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sunny_0211: 金币+2, 有帮助, 谢谢您 2012-12-09 23:57:29
你这处理了五个小时,再牛的RNA也降解了……
还是老老实实液氮研磨之后用Trizol融比较好
3楼2012-12-01 13:22:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sunny_0211: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢您 2012-12-09 23:53:27
样品处理时间过长对RNA肯定有影响。如果非要处理的话,能否在处理过成中加蛋白酶K抑制核酸酶?
此外,你的样品是否做了DNA消化?感觉杂质多。反向电泳条带可能也说明有其他杂质结合核酸,带正点,所以往反向跑了。
2楼2012-12-01 09:09:03
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sunny_0211

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-01 09:09:03
样品处理时间过长对RNA肯定有影响。如果非要处理的话,能否在处理过成中加蛋白酶K抑制核酸酶?
此外,你的样品是否做了DNA消化?感觉杂质多。反向电泳条带可能也说明有其他杂质结合核酸,带正点,所以往反向跑了。

你好 谢谢您的意见  样品没有经过DNA消化 杂质较多 我也怀疑是杂质结合了核酸 至于处理时间的问题 我参照了拟南芥原生质体转化的方法,其中在提取出原生质体后还要进行约16小时的转化,使目的蛋白表达观察荧光,进行定位,所以,估计不是由于前期处理时间过长造成的。万分感谢您 十分抱歉我回复晚了(生病了) 谢谢您
4楼2012-12-09 23:52:49
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sunny_0211

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-12-01 13:22:31
你这处理了五个小时,再牛的RNA也降解了……
还是老老实实液氮研磨之后用Trizol融比较好

首先谢谢您的意见 我参考了拟南芥原生质体转化的方法,在4-5小时酶解处理后,还要转入连接有目的蛋白的载体,进过约16小时的表达,观察荧光。估计前期处理的影响不太大。十分感谢您的帮助,抱歉我回复晚了(生病了) 谢谢
5楼2012-12-09 23:56:56
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