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sunny_0211

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[求助] 【求助/交流】拟南芥保卫细胞原生质体RNA提取电泳图，出现反向弥散？已有1人参与

我需要先对拟南芥保卫细胞提取原生质体，需要大概5小时左右，然后加入Trozol试剂，氯仿去蛋白，异丙醇沉淀，测RNA含量在4000ng/ul左右，但是甲醛变型胶电泳无条带，或是出现5S条带。
请问是RNA降解了吗？还是我就没提取出来？前期的酶解提取原生质体过程较长。对后续提取RNA是否产生了影响？
本人计划提取RNA用于文库构建，一直不能解决RNA提取的问题，十分着急，希望做过这方面实验的同学、老师、专家能够给予宝贵意见，不胜感激

PS：有时候点样孔反向出现弥散状条带，于是反向电泳出现一条亮带，这是什么情况？

FX-RNA_副本.jpg

RNA1_副本.jpg

RNA25min.jpg

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1楼 2012-11-30 13:24:12

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sunny_0211

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引用回帖:

2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-01 09:09:03
样品处理时间过长对RNA肯定有影响。如果非要处理的话，能否在处理过成中加蛋白酶K抑制核酸酶？
此外，你的样品是否做了DNA消化？感觉杂质多。反向电泳条带可能也说明有其他杂质结合核酸，带正点，所以往反向跑了。

你好谢谢您的意见样品没有经过DNA消化杂质较多我也怀疑是杂质结合了核酸至于处理时间的问题我参照了拟南芥原生质体转化的方法，其中在提取出原生质体后还要进行约16小时的转化，使目的蛋白表达观察荧光，进行定位，所以，估计不是由于前期处理时间过长造成的。万分感谢您十分抱歉我回复晚了（生病了）谢谢您