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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒提取
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

[交流] 质粒提取

最近在质粒抽提的时候遇到一个头痛的问题，质粒是真核质粒，抽出来浓度1000ug/ml左右，A260/A280=1.85左右，但是跑琼脂糖凝胶电泳时，却没有条带或条带很暗。连续好几个质粒都遇到这个问题了，请问大侠们这是怎么回事啊！
另外：新抽提的原核质粒在相同浓度下，也没有以前抽提的亮度大。

[ Last edited by aofeng860308 on 2012-11-27 at 18:43 ]
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czdaeq

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1楼 2012-11-26 15:43:29
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)
★
aofeng860308(金币+1): 谢谢参与
把所有东西全部换掉再抽
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2楼2012-11-26 19:22:54
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)
★
aofeng860308(金币+1): 谢谢参与
提取用的试剂可能不在最佳状态了
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3楼2012-11-26 19:30:10
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-26 19:22:54
把所有东西全部换掉再抽

新的试剂盒抽出来的也一样啊
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4楼2012-11-26 19:59:39
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 德国工兵铲 at 2012-11-26 19:30:10
提取用的试剂可能不在最佳状态了

换了新试剂盒还是这样，还有其他解决的办法吗？
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5楼2012-11-26 20:00:35
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)
★
aofeng860308(金币+1): 谢谢参与
别是你的EB或者其他染料不行了……
主要是你这浓度看着也不差啊~
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6楼2012-11-26 21:22:45
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czdaeq

铜虫 (著名写手)
★
aofeng860308(金币+1): 谢谢参与
送鲜花一朵
1、预热EB；2、烘干乙醇（貌似Wash Buffer）；3、那个柱子的吸附DNA效率不高的话，可以反复过柱子次（若是有核酸定量仪，测测滤出的废液看看与之前相比核酸量有没有显著下降）
暂时就想到这些。
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7楼2012-11-26 22:16:46
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-26 21:22:45
别是你的EB或者其他染料不行了……
主要是你这浓度看着也不差啊~

这个是确定没有问题的，其他PCR产物都是用同一批电泳胶跑出来的，都很正常。
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8楼2012-11-26 22:48:02
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by czdaeq at 2012-11-26 22:16:46
1、预热EB；2、烘干乙醇（貌似Wash Buffer）；3、那个柱子的吸附DNA效率不高的话，可以反复过柱子次（若是有核酸定量仪，测测滤出的废液看看与之前相比核酸量有没有显著下降）
暂时就想到这些。

这个应该是浓度不高才要进行的操作吧，我现在是浓度纯度都挺好，就是跑电泳没有条带或条带很暗。
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9楼2012-11-26 23:01:58
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hzlatqh

银虫 (小有名气)
★
aofeng860308(金币+1): 谢谢参与
1000ug/ul ？那是相当的高啊。。。一般原核质粒不都是才100ng/ul左右，看到的条带已经相当明显。。。可能是染色的EB太旧了效果不好？或者实验环境中有DNase污染？你可以试试把染过的胶放置不同时间再照UV看看是否条带有减弱趋势来初步判断。。。
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10楼2012-11-26 23:45:32
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
感觉是跑胶的问题
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11楼2012-11-27 08:53:30
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by jl860822 at 2012-11-27 08:53:30
感觉是跑胶的问题

可是同一批跑胶的其他样品都是好的
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12楼2012-11-27 18:42:31
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by hzlatqh at 2012-11-26 23:45:32
1000ug/ul ？那是相当的高啊。。。一般原核质粒不都是才100ng/ul左右，看到的条带已经相当明显。。。可能是染色的EB太旧了效果不好？或者实验环境中有DNase污染？你可以试试把染过的胶放置不同时间再照UV看看是否条 ...

打错了，应该是1000ug/ml，但是也是普通原核质粒的10倍左右。染色的和DNase酶污染应该都没有问题，我同一批跑的其他样品都是正常的。
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13楼2012-11-27 22:53:25
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hzlatqh

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-11-27 22:53:25
打错了，应该是1000ug/ml，但是也是普通原核质粒的10倍左右。染色的和DNase酶污染应该都没有问题，我同一批跑的其他样品都是正常的。...

那估计就是DNA浓度检测受到严重干扰了 如果DNA有1000ng/ul的话，染色肯定能看到。所以紫外法测得数值值得怀疑
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14楼2012-11-27 23:39:26
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Marado

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果都出问题了的话，我估计是配胶的问题，胶浓度不对，或者染色试剂出问题了……重配下试试，或者去别的实验室蹭块胶看看
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15楼2012-11-28 08:50:44
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by Marado at 2012-11-28 08:50:44
如果都出问题了的话，我估计是配胶的问题，胶浓度不对，或者染色试剂出问题了……重配下试试，或者去别的实验室蹭块胶看看

不是全部，就是某些样品出了这个问题！
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16楼2012-11-28 18:32:18
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by hzlatqh at 2012-11-27 23:39:26
那估计就是DNA浓度检测受到严重干扰了 如果DNA有1000ng/ul的话，染色肯定能看到。所以紫外法测得数值值得怀疑...

奇怪就奇怪在这个地方，电泳和测浓度都是有其他样品一起做的，测浓度全部正常，但是跑电泳就有些不正常了！
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17楼2012-11-28 18:34:46
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食品科学2012

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
应该是你的EB有问题！
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18楼2012-11-28 21:03:32
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 食品科学2012 at 2012-11-28 21:03:32
应该是你的EB有问题！

一起跑的其他样品和Marker都是正常的
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19楼2012-11-29 10:31:47
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1215216349

新虫 (小有名气)
握爪
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20楼2017-04-26 16:03:53
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1215216349

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主，搞定了么，我也有这种情况，不知道是不是跑弥散了。
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21楼2017-04-26 16:05:50
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