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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达
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金虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达

我最近在做原核表达，实验中出现很奇怪的现象（下面有图）。由于以前没有做过，希望大家给予帮助啊，谢谢大家啊。
（28摄氏度诱导了5个小时，目的蛋白没有诱导出来：15KD左右，Marker：10,15,25,35.。。。。）

20121121607.jpg
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1楼2012-11-22 13:25:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你上的是全蛋白还是可溶蛋白？是用IPTG诱导的吗？话说回来，你的蛋白样品处理有问题啊，怎么是模糊一片的。可能胶也没有做太好。
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2楼2012-11-22 13:32:07
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jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
胶没跑好，样品也没处理好。蛋白有没有表达尚不能判定。
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快乐棒棒糖
静心做事。
3楼2012-11-22 13:42:44
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快乐棒棒糖

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-22 13:32:07
你上的是全蛋白还是可溶蛋白？是用IPTG诱导的吗？话说回来，你的蛋白样品处理有问题啊，怎么是模糊一片的。可能胶也没有做太好。

是用IPTG诱导的全蛋白。我第一次做，是按照文献上的方法处理的蛋白样品。你们做原核表达有经验，能告诉我蛋白样品处理的具体过程吗？还有制胶的注意事项。谢谢啦！
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4楼2012-11-23 18:56:29
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快乐棒棒糖

金虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by jiangyhai at 2012-11-22 13:42:44
胶没跑好，样品也没处理好。蛋白有没有表达尚不能判定。

恩我用的是80V跑浓缩胶，然后用的120v跑分离胶。菌液离心后用PBS洗一次，然后又用PBS溶解，之后就交上样缓冲液，100摄氏度煮沸10分钟，然后就点样了。有什么错误的地方希望请给予指点。谢谢啊，也希望虫友能分享一下你们的经验。谢谢啊
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5楼2012-11-23 21:52:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 快乐棒棒糖 at 2012-11-23 21:52:53
恩我用的是80V跑浓缩胶，然后用的120v跑分离胶。菌液离心后用PBS洗一次，然后又用PBS溶解，之后就交上样缓冲液，100摄氏度煮沸10分钟，然后就点样了。有什么错误的地方希望请给予指点。谢谢啊，也希望虫友能分享一 ...

煮过的样品最好离心一下，否则可能会有不溶物可能堵塞胶。还有，如果第一次做这个蛋白诱导，要摸一下IPTG的条件（IPTG浓度、时间、温度等）。文献上说的条件不一定完全适合。
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6楼2012-11-24 02:29:13
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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同意六楼的意见，优化一下条件，对你的蛋白表达有用，再说28度诱导5小时，时间可能短，要是可溶性表达建议诱导时间长些温度高些
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7楼2012-11-24 08:39:36
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快乐棒棒糖

金虫 (初入文坛)
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引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-24 02:29:13
煮过的样品最好离心一下，否则可能会有不溶物可能堵塞胶。还有，如果第一次做这个蛋白诱导，要摸一下IPTG的条件（IPTG浓度、时间、温度等）。文献上说的条件不一定完全适合。...

恩，忘记说了，我煮过之后离心10分钟才上样的。上图就是在固定温度条件下，IPTG浓度分别为0.2,0.4,0.6，0.8，1进行诱导的。（从左到右）我就是想先确定IPTG的浓度在摸索温度和时间的，因为实验室条件有限。
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8楼2012-11-24 08:57:00
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金虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by xj0311 at 2012-11-24 08:39:36
同意六楼的意见，优化一下条件，对你的蛋白表达有用，再说28度诱导5小时，时间可能短，要是可溶性表达建议诱导时间长些温度高些

恩，知道了，谢谢啊。我查过一些资料和我做的同一种基因在不同的物种上好像都是包涵体沉淀，那我应该怎么做啊？
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9楼2012-11-24 08:58:32
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hippo_li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是上样量太大了，完全看不到条带，感觉是蛋白太多了全部连成一片，上样量减少一些看看能不能跑成条带吧。SDS-PAGE分辨率挺高的，不需要上太多样品。
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10楼2012-11-24 11:01:18
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