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lxh502976898

金虫 (小有名气)

[交流] 蛋白纯化 已有2人参与

我的目的蛋白在组氨酸标签，纯化用的是亲和柱，但是做SDS，上样前后没有变化，基本确定蛋白没挂在柱子上，求帮助。。。。
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1楼 2012-10-30 10:44:03
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-30 16:00:57
你的蛋白是上清表达吧
这种情况下，你调整你的样品缓冲液的PH值和增减离子强度会起到效果。
不知道你具体的实验条件，只能给你这些建议
如果还没解决我再给你其他的办法
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2楼2012-10-30 11:18:09
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gelois

金虫 (正式写手)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-30 16:01:06
首先确定你的破菌Buffer是否合适，PH，盐离子浓度等等。
如果没有问题那么就怀疑是否His标签被蛋白包被在里面，所以才挂不上柱子。这样的话，就要在养菌的时候降低温度，或者尝试加点尿素使His标签露出来。
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3楼2012-10-30 14:00:21
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yongbo_liang at 2012-10-30 11:18:09
你的蛋白是上清表达吧
这种情况下，你调整你的样品缓冲液的PH值和增减离子强度会起到效果。
不知道你具体的实验条件，只能给你这些建议
如果还没解决我再给你其他的办法

样品缓冲液的PH值和增减离子强度 能具体一点说吗，
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4楼2012-10-30 16:16:11
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gelois at 2012-10-30 14:00:21
首先确定你的破菌Buffer是否合适，PH，盐离子浓度等等。
如果没有问题那么就怀疑是否His标签被蛋白包被在里面，所以才挂不上柱子。这样的话，就要在养菌的时候降低温度，或者尝试加点尿素使His标签露出来。

我加IPTG诱导表达，目的蛋白分子量5000左右，而SDS显示10000左右，纯化的时侯又挂不上柱子
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5楼2012-10-30 16:18:23
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-31 15:09:26
首先的是在你的目前纯化缓冲液上下功夫
如果你的缓冲液是PBS，那么可以尝试去掉其中的高浓度NaCl，或是再提高盐离子浓度。PH值也可以尝试。
其次，如果你的目的蛋白在后续的检测中没有特别的要求的话，如样品溶液中不能有脲素或其他的表面活性剂的话
就可以采用向其中加脲素或其他的表面活性剂。
这2个方法看你的实验要求
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6楼2012-10-31 08:34:38
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gelois

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-10-30 16:18:23
我加IPTG诱导表达，目的蛋白分子量5000左右，而SDS显示10000左右，纯化的时侯又挂不上柱子...

10000左右？你的蛋白不会是聚合了吧？介意可以尝试跑一个非变性胶看看~
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7楼2012-10-31 08:46:27
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