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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请大家帮我看看我的southern blot 图片，不知道问题出在哪里了，谢谢
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wandahuan

铜虫 (小有名气)

[求助] 请大家帮我看看我的southern blot 图片，不知道问题出在哪里了，谢谢 已有1人参与

southern blot 实验目的是为了验证突变体基因被敲除（1,2分别是两个不同突变体）
1.使用单酶切5小时左右；
2.基因组DNA浓度约为450ng/uL，上样量每孔50微升，跑胶（0.8%）5小时左右，条带很亮；
3.试剂盒是Roche Kit I, 洗脱条件为：68℃  2×SSC，0.1%SDS 洗30min, 68℃  0.5×SSC，0.1%SDS 洗15min，洗两次；
4.探针是PCR目的基因部分片段的回收产物，大小约为400和700bp。
问题：
探针第一和第二次用的相同，第一次Marker（TAKARA DL15000）未杂出条带，目的基因野生型与突变体有目的条带；
第二次-1基因做出来了，-2效果不太好；
第三次-1是新做的探针，有杂带，背景信号也很高，-2仍是之前的探针，却没有杂出目标条带。

麻烦大家帮我分析分析是什么原因，有什么好的解决方法。不甚感激~~~~

第一次-1.jpg



第一次-2.jpg



第二次-1.jpg



第二次-2.jpg



第三次-1.jpg



第三次-2.jpg
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1楼 2012-10-15 10:37:27
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lily981107

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极交流经验 2012-10-24 15:13:47
是什么材料的总DNA？真菌的总量5-10ug即可，植物的20ug左右。图中判断似乎没有22ug的总量，总DNA量不够是原因之一。此外marker太多，加入5ng即可。建议下次加入用做探针的pcr产物做对照（多加一个孔），是监控反应体系的标准之一。如果marke和pcr产物对应条带都很清楚，而样品没有条带，其可能原因有两点：DNA量不够，转膜效率太低。
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5楼2012-10-20 11:54:04
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普通回帖

iriskye

银虫 (小有名气)
能不能请教您探针是怎么设计的？
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2楼2012-10-16 22:54:15
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wandahuan

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by iriskye at 2012-10-16 22:54:15
能不能请教您探针是怎么设计的？

PCR目标基因上游或者下游片段，回收后与marker煮沸后加入1号液制成。
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3楼2012-10-17 21:53:21
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iriskye

银虫 (小有名气)
谢谢！
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4楼2012-10-18 00:19:33
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wandahuan

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lily981107 at 2012-10-20 11:54:04
是什么材料的总DNA？真菌的总量5-10ug即可，植物的20ug左右。图中判断似乎没有22ug的总量，总DNA量不够是原因之一。此外marker太多，加入5ng即可。建议下次加入用做探针的pcr产物做对照（多加一个孔），是监控反应体 ...

我做的是细菌的，每孔总量为20ug左右。我后面用相同的DNA又做了一次，这次效果还不错，条带都很清晰，不过不同的是把探针换了，而且探针煮沸后冰浴着，再加入杂交液的。
不知道您有没有检测探针浓度的方法，Roche Kit I 的英文说明书有些看不明白。。。。
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6楼2012-10-28 20:39:35
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lily981107

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

在任何实验中，只要提到是加热变性，煮沸后一定是要冰浴的，之前你没有冰浴吗？
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7楼2012-10-30 08:52:54
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lily981107

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-30 13:39:48
引用回帖:
6楼: Originally posted by wandahuan at 2012-10-28 20:39:35
我做的是细菌的，每孔总量为20ug左右。我后面用相同的DNA又做了一次，这次效果还不错，条带都很清晰，不过不同的是把探针换了，而且探针煮沸后冰浴着，再加入杂交液的。
不知道您有没有检测探针浓度的方法，Roche ...

细菌总DNA不需要这么多，是不是浓度测定方法有大误差或者是酶切后纯化时损失太多？一般情况核酸浓度确定需要电泳和分光光度计测定结合，探针标记前测定即可。
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8楼2012-10-30 09:02:32
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wandahuan

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lily981107 at 2012-10-30 09:02:32
细菌总DNA不需要这么多，是不是浓度测定方法有大误差或者是酶切后纯化时损失太多？一般情况核酸浓度确定需要电泳和分光光度计测定结合，探针标记前测定即可。...

之前探针使用时煮沸后未冰浴。。。。实验室流传下来的方法没有这一步。
细菌基因组DNA是用仪器测的，探针用的片段未测浓度。。。
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9楼2012-10-31 18:50:03
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wandahuan

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lily981107 at 2012-10-30 09:02:32
细菌总DNA不需要这么多，是不是浓度测定方法有大误差或者是酶切后纯化时损失太多？一般情况核酸浓度确定需要电泳和分光光度计测定结合，探针标记前测定即可。...

酶切之后，我们没有纯化，第二天直接上样跑电泳的。。。。。
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10楼2012-10-31 18:52:55
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