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爱笑的大脸猫

新虫 (小有名气)

你好,我也在做southern-blot,不过我是新手,做出来后背景特别高敢问大神该怎么解决?还有68℃  2×SSC,0.1%SDS 洗30min, 68℃  0.5×SSC,0.1%SDS 您是高压灭菌除菌还是过滤除菌?求回复,感激不尽!
越努力,越幸运!
11楼2014-05-05 14:53:06
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wandahuan

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 爱笑的大脸猫 at 2014-05-05 14:53:06
你好,我也在做southern-blot,不过我是新手,做出来后背景特别高敢问大神该怎么解决?还有68℃  2×SSC,0.1%SDS 洗30min, 68℃  0.5×SSC,0.1%SDS 您是高压灭菌除菌还是过滤除菌?求回复,感激不尽!

高温灭菌的。。。背景高可能是探针浓度过高了,吸取一点探针出来稀释3~5倍试试。。。Marker亮度如何?目的条带都能杂交出来么?
12楼2014-05-07 14:37:32
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爱笑的大脸猫

新虫 (小有名气)

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12楼: Originally posted by wandahuan at 2014-05-07 14:37:32
高温灭菌的。。。背景高可能是探针浓度过高了,吸取一点探针出来稀释3~5倍试试。。。Marker亮度如何?目的条带都能杂交出来么?...

谢谢,我试着高压灭菌,把探针浓度降低5倍,阳性对照条带明显,但是实验组没有条带,我提取的DNA 浓度是238ng/ul用TAKALA的酶进行酶切,酶切体系是
EcoR1 1ul,BUf 2ul, DNA5ul(说明书上说DNA<1ug), 无菌水12ul,酶切后上样40ul,这样上样量才2ug。请问您是怎么保证上样量20ug的???谢谢
越努力,越幸运!
13楼2014-05-12 09:27:38
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wandahuan

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 爱笑的大脸猫 at 2014-05-12 09:27:38
谢谢,我试着高压灭菌,把探针浓度降低5倍,阳性对照条带明显,但是实验组没有条带,我提取的DNA 浓度是238ng/ul用TAKALA的酶进行酶切,酶切体系是
EcoR1 1ul,BUf 2ul, DNA5ul(说明书上说DNA<1ug), 无菌水12 ...

对不起额,最近上课比较忙,很久没来小木虫看了。。。我记得我是每次切100 ul 体系,79 ul DNA,(浓度200微克以上),单酶切的话 酶7微升,buffer 14ul,酶切5小时或者过夜都可以。。。。
14楼2014-05-14 20:47:56
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爱笑的大脸猫

新虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by wandahuan at 2014-05-14 20:47:56
对不起额,最近上课比较忙,很久没来小木虫看了。。。我记得我是每次切100 ul 体系,79 ul DNA,(浓度200微克以上),单酶切的话 酶7微升,buffer 14ul,酶切5小时或者过夜都可以。。。。...

好的,谢谢,那你的上样量差不多就100ul 啊!?
越努力,越幸运!
15楼2014-05-16 09:50:52
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webrother

银虫 (小有名气)

您好! 我是一名southern blot新手,我想请教您一些实验经验?能留个联系方式交流吗?很期待您的回复!
发扬钉子精神
16楼2016-01-23 23:18:04
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17621933862

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你好,看见楼主SOUTHERN BLOT做的很好,我真是羡慕,我做nothernblot,总是做不出来
17楼2019-05-27 13:02:44
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