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wandahuan

铜虫 (小有名气)

[求助] 请大家帮我看看我的southern blot 图片,不知道问题出在哪里了,谢谢已有1人参与

southern blot 实验目的是为了验证突变体基因被敲除(1,2分别是两个不同突变体)
1.使用单酶切5小时左右;
2.基因组DNA浓度约为450ng/uL,上样量每孔50微升,跑胶(0.8%)5小时左右,条带很亮;
3.试剂盒是Roche Kit I, 洗脱条件为:68℃  2×SSC,0.1%SDS 洗30min, 68℃  0.5×SSC,0.1%SDS 洗15min,洗两次;
4.探针是PCR目的基因部分片段的回收产物,大小约为400和700bp。
问题:
探针第一和第二次用的相同,第一次Marker(TAKARA DL15000)未杂出条带,目的基因野生型与突变体有目的条带;
第二次-1基因做出来了,-2效果不太好;
第三次-1是新做的探针,有杂带,背景信号也很高,-2仍是之前的探针,却没有杂出目标条带。

麻烦大家帮我分析分析是什么原因,有什么好的解决方法。不甚感激~~~~

第一次-1.jpg



第一次-2.jpg



第二次-1.jpg



第二次-2.jpg



第三次-1.jpg



第三次-2.jpg
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爱笑的大脸猫

新虫 (小有名气)

你好,我也在做southern-blot,不过我是新手,做出来后背景特别高敢问大神该怎么解决?还有68℃  2×SSC,0.1%SDS 洗30min, 68℃  0.5×SSC,0.1%SDS 您是高压灭菌除菌还是过滤除菌?求回复,感激不尽!
越努力,越幸运!
11楼2014-05-05 14:53:06
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爱笑的大脸猫

新虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by wandahuan at 2014-05-07 14:37:32
高温灭菌的。。。背景高可能是探针浓度过高了,吸取一点探针出来稀释3~5倍试试。。。Marker亮度如何?目的条带都能杂交出来么?...

谢谢,我试着高压灭菌,把探针浓度降低5倍,阳性对照条带明显,但是实验组没有条带,我提取的DNA 浓度是238ng/ul用TAKALA的酶进行酶切,酶切体系是
EcoR1 1ul,BUf 2ul, DNA5ul(说明书上说DNA<1ug), 无菌水12ul,酶切后上样40ul,这样上样量才2ug。请问您是怎么保证上样量20ug的???谢谢
越努力,越幸运!
13楼2014-05-12 09:27:38
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爱笑的大脸猫

新虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by wandahuan at 2014-05-14 20:47:56
对不起额,最近上课比较忙,很久没来小木虫看了。。。我记得我是每次切100 ul 体系,79 ul DNA,(浓度200微克以上),单酶切的话 酶7微升,buffer 14ul,酶切5小时或者过夜都可以。。。。...

好的,谢谢,那你的上样量差不多就100ul 啊!?
越努力,越幸运!
15楼2014-05-16 09:50:52
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