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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请大家帮我看看我的southern blot 图片，不知道问题出在哪里了，谢谢
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wandahuan

铜虫 (小有名气)

[求助] 请大家帮我看看我的southern blot 图片，不知道问题出在哪里了，谢谢已有1人参与

southern blot 实验目的是为了验证突变体基因被敲除（1,2分别是两个不同突变体）
1.使用单酶切5小时左右；
2.基因组DNA浓度约为450ng/uL，上样量每孔50微升，跑胶（0.8%）5小时左右，条带很亮；
3.试剂盒是Roche Kit I, 洗脱条件为：68℃  2×SSC，0.1%SDS 洗30min, 68℃  0.5×SSC，0.1%SDS 洗15min，洗两次；
4.探针是PCR目的基因部分片段的回收产物，大小约为400和700bp。
问题：
探针第一和第二次用的相同，第一次Marker（TAKARA DL15000）未杂出条带，目的基因野生型与突变体有目的条带；
第二次-1基因做出来了，-2效果不太好；
第三次-1是新做的探针，有杂带，背景信号也很高，-2仍是之前的探针，却没有杂出目标条带。

麻烦大家帮我分析分析是什么原因，有什么好的解决方法。不甚感激~~~~

第一次-1.jpg



第一次-2.jpg



第二次-1.jpg



第二次-2.jpg



第三次-1.jpg



第三次-2.jpg
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1楼2012-10-15 10:37:27
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爱笑的大脸猫

新虫 (小有名气)
你好，我也在做southern-blot，不过我是新手，做出来后背景特别高敢问大神该怎么解决？还有68℃  2×SSC，0.1%SDS 洗30min, 68℃  0.5×SSC，0.1%SDS 您是高压灭菌除菌还是过滤除菌？求回复，感激不尽！
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越努力，越幸运！
11楼2014-05-05 14:53:06
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爱笑的大脸猫

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by wandahuan at 2014-05-07 14:37:32
高温灭菌的。。。背景高可能是探针浓度过高了，吸取一点探针出来稀释3~5倍试试。。。Marker亮度如何？目的条带都能杂交出来么？...

谢谢，我试着高压灭菌，把探针浓度降低5倍，阳性对照条带明显，但是实验组没有条带，我提取的DNA 浓度是238ng/ul用TAKALA的酶进行酶切，酶切体系是
EcoR1 1ul，BUf 2ul， DNA5ul(说明书上说DNA<1ug), 无菌水12ul，酶切后上样40ul,这样上样量才2ug。请问您是怎么保证上样量20ug的？？？谢谢
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越努力，越幸运！
13楼2014-05-12 09:27:38
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爱笑的大脸猫

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by wandahuan at 2014-05-14 20:47:56
对不起额，最近上课比较忙，很久没来小木虫看了。。。我记得我是每次切100 ul 体系，79 ul DNA，（浓度200微克以上），单酶切的话 酶7微升，buffer 14ul，酶切5小时或者过夜都可以。。。。...

好的，谢谢，那你的上样量差不多就100ul 啊！？
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越努力，越幸运！
15楼2014-05-16 09:50:52
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