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weining1203新虫 (小有名气)
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做原核表达又出现问题了
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做原核表达，使用pET-32a表达载体，酶切位点为sacI和Xhol， 上游引物 5G GAGCTC（SacI）ATGGTTGCAGCAGCAGAAAT3 下游引物 5CCG CTCGAG（Xhol）TCAGAATGGGCCAGGAGTTC3 问题就在这，实验室的pET-32a酶切位点发生突变了，于是问同学要，结果它只有pET-28a，同学不做相关的实验，不知道能不能通用，有点着急，请做过的同学指点一下迷津，先谢谢了 |
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weining1203
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3楼2012-10-13 09:33:36
cicelyzh
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【答案】应助回帖
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| pET-28a也有你设计的那两个酶切位点，所以可以用。不过28a没有Trx-tag。 |
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2楼2012-10-13 08:07:09
【答案】应助回帖
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weining1203: 金币+8, ★★★很有帮助 2012-10-16 19:33:32
| pET-28a与pET32a不一样的是它没有Trx-tag和S-tag，只有His-tag。Trx-tag是硫氧还蛋白，可以助溶，如果你本身的蛋白表达出来可溶性就很高，没有Trx-tag也没关系，但是如果你的蛋白本身可溶性低的话，用pET28a表达出来的就可能是包涵体。S-tag和His-tag都是可以用来做westen blot的标签，其中His-tag可以用来纯化蛋白。 |
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4楼2012-10-13 09:53:44
cicelyzh
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【答案】应助回帖
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Trx-tag和GST-tag都可以增加融合蛋白的可溶性。如果你要表达的蛋白水溶性差容易形成包涵体，多个tag会有帮助。对大多数可溶蛋白来说，没有trx-tag影响不大，pET-28a也是大家常用的一个表达载体。 |
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5楼2012-10-13 09:55:34
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