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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 弄不明白原因
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cm_1101

新虫 (初入文坛)

[交流] 弄不明白原因

请教各位老师：本人之前做了一个PET32载体表达，先挑一个单克隆在1ml带Amp的LB ，37°摇18h，第二天按（1；30）接种之5ml带Amp的LB中，先再37°摇3个半小时，然后在25°加IPTG的使用的浓度为0.25mmol/ml，诱导6个半小时。通过用12%SDS-PAGE能看见表达的目的带，而且很清楚。之后重新把接种体积从5ml变成500ml用相同的条件做实验。但从12%SDS-PAGE却不能看见表达的目的带，请问这是什么原因？急急急！
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1楼 2012-09-24 17:57:51
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junminh

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小量放大条件优化下，既然小量都能表达，说明整个体系是应该是没有问题的，条件摸索下。
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3楼2012-09-25 10:03:40
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houchm0927

金虫 (小有名气)
★
cm_1101(金币+1): 谢谢参与
蛋白在上清还是在沉淀里？如果相同的诱导条件下连沉淀里都没你的目的蛋白，那就说明你的宿主菌有问题了。
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2楼2012-09-24 19:44:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-25 14:35:54
做诱导表达不仅和IPTG浓度，诱导时间，收菌时候的OD有关。看你的情况，扩大培养后由于液体表面积/菌液体积不同了，即使摇菌速度一样，菌生长的状态会不同，表达效果当然不一样。如果是想扩大培养，最好是在原来的条件基础上优化一下条件。比如IPTG浓度，诱导时间（取少量样品并记录OD）。
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4楼2012-09-25 12:26:10
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