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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] 做原核表达引物设计的有关问题

克隆了目的基因，含有一个完整的ORF，现在想做原核表达，表达载体为pET-32a，酶切位点选择SacI和XhoI，现有如下问题想请教大家：
1 是不是直接把酶切位点放在引物的5端
2 加什么样的保护碱基
3 加上酶切位点和保护碱基后在表达蛋白时会不会引起阅读框发生错位使得蛋白不能表达或表达的蛋白与预期的不同，若阅读框发生错位，应该怎么设计引物。

本人是新手，很多问题都不清楚，求大神详细解答。
附：克隆引物，上游 5-ATGGTTGCAGCAGCAGAAAT-3
                       下游 5-TCAGAATGGGCCAGGAGTTC-3

附件里有pET-32a图谱
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  • 附件 1 : pET32a原核表达载体.pdf
    • 2012-09-14 22:19:19, 44.83 K

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1楼 2012-09-14 22:23:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ybs007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1949stone: MolEPI+1, 很好 2012-09-15 08:12:33
1.先把你的酶切位点加到目的片段上，然后再正常设计引物就可以了。
2.保护碱基有好多种选择，但是加不同的保护碱基会影响你酶切的效率。
3.酶切位点的引入不会改变读码框的位置，因为你酶切之后还是要做连接的，酶切位点会翻译成两个氨基酸。保护碱基不会影响读码框位置，因为它会被酶切掉。
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weining1203
平生我自知
2楼2012-09-14 22:55:03
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普通回帖

ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+2, 很好的建议 2012-09-15 08:13:30
建议不加保护碱基，上游直接加酶切位点，下游在互补条带末端加酶切位点，用引物设计软件很方便的，设计，pcr出来的产物直接胶回收连接t载体

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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weining1203
有时候，一句话，可以改变未来
3楼2012-09-15 00:49:15
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weining1203

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by ybs007 at 2012-09-14 22:55:03
1.先把你的酶切位点加到目的片段上，然后再正常设计引物就可以了。
2.保护碱基有好多种选择，但是加不同的保护碱基会影响你酶切的效率。
3.酶切位点的引入不会改变读码框的位置，因为你酶切之后还是要做连接的，酶 ...

表达的时候是从载体的ATG开始，还是引物的ATG开始呀，很多帖子说设计引物是要注意不要引起读码框改变，这里不是很懂，怎么避免这个问题啊
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4楼2012-09-15 08:09:17
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weining1203

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-09-15 00:49:15
建议不加保护碱基，上游直接加酶切位点，下游在互补条带末端加酶切位点，用引物设计软件很方便的，设计，pcr出来的产物直接胶回收连接t载体

上游为什么不加保护碱基，您说的下游互补条带末端是3‘  还是5’ ，下游要加保护碱基吗，还有，下游的酶切位点还用反向互补吗
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5楼2012-09-15 08:11:54
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-15 13:36:53
引用回帖:
5楼: Originally posted by weining1203 at 2012-09-15 08:11:54
上游为什么不加保护碱基，您说的下游互补条带末端是3‘  还是5’ ，下游要加保护碱基吗，还有，下游的酶切位点还用反向互补吗...

1.上下游都不加保护碱基，连接T载体相当于加了一个T载体这么长的保护碱基2.下游末端是5\'，酶切位点都是在5\'加的3.酶切位点都是回文序列，反向跟反向互补是一样的

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有时候，一句话，可以改变未来
6楼2012-09-15 08:41:52
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-09-15 08:41:52
1.上下游都不加保护碱基，连接T载体相当于加了一个T载体这么长的保护碱基2.下游末端是5\'，酶切位点都是在5\'加的3.酶切位点都是回文序列，反向跟反向互补是一样的
...

谢谢回复，好像明白一点了，连完T载体还要连接表达载体pet-32a做表达，不用加保护碱基吗？
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7楼2012-09-15 10:51:45
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by weining1203 at 2012-09-15 10:51:45
谢谢回复，好像明白一点了，连完T载体还要连接表达载体pet-32a做表达，不用加保护碱基吗？...

引物设定好了就不能再变了，除非重新设定引物，我建议你设定的引物不加保护碱基

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有时候，一句话，可以改变未来
8楼2012-09-15 11:30:31
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-18 15:46:55
我觉得这种情况的话，设计引物的时候可以不加保护碱基，pcr产物连接T载体，连T之后就无所谓有没有保护碱基了。

关于阅读框移码的问题，我们一般设计引物的时候应该尽量避免有ATG的出现，不过即便是有的话，我个人觉得只要你引物的ATG 和阅读框的ATG之间的碱基数是3的倍数的话也应该是没问题的。可是这样的话，你的翻译产物可能就变了。
我也是一直没弄清楚在引物里面有ATG的情况下，翻译的时候是从哪个ATG开始翻译的问题。可以一起讨论一下，呵呵……
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weining1203
9楼2012-09-17 16:32:44
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by jingdejun at 2012-09-17 16:32:44
我觉得这种情况的话，设计引物的时候可以不加保护碱基，pcr产物连接T载体，连T之后就无所谓有没有保护碱基了。

关于阅读框移码的问题，我们一般设计引物的时候应该尽量避免有ATG的出现，不过即便是有的话，我个人 ...

呵呵，共同学习
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10楼2012-09-17 17:21:42
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