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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做原核表达引物设计的有关问题
汕头大学海洋科学接受调剂
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by jingdejun at 2012-09-17 16:32:44
我觉得这种情况的话，设计引物的时候可以不加保护碱基，pcr产物连接T载体，连T之后就无所谓有没有保护碱基了。

关于阅读框移码的问题，我们一般设计引物的时候应该尽量避免有ATG的出现，不过即便是有的话，我个人 ...

还想请教您一个问题，我的目的片段2157bp，一个完整的ORF，要先连接T载体，那种T载体好啊，还有选用那家的T4连接酶，谢谢
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11楼2012-09-17 17:32:52
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-18 15:47:08
引用回帖:
11楼: Originally posted by weining1203 at 2012-09-17 17:32:52
还想请教您一个问题，我的目的片段2157bp，一个完整的ORF，要先连接T载体，那种T载体好啊，还有选用那家的T4连接酶，谢谢...

T载体不存在哪种好与不好，只有适合不适合。
现在比较常用的有pMD19-T和pMD20-T。
试剂盒里面自带的有buffer（solution I），不需要自己再买连接酶，只需要算好自己的插入片段的浓度，按照说明书加样，反应只需要5分钟（一般不按照这个时间来）就可以完成。
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weining1203
12楼2012-09-17 22:44:27
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by jingdejun at 2012-09-17 22:44:27
T载体不存在哪种好与不好，只有适合不适合。
现在比较常用的有pMD19-T和pMD20-T。
试剂盒里面自带的有buffer（solution I），不需要自己再买连接酶，只需要算好自己的插入片段的浓度，按照说明书加样，反应只需要 ...

谢谢您的回复，那么pMD19-T适合我的片段吗，是哪家公司的？连接只需5分钟好快啊，看很多都是过夜连接的
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13楼2012-09-18 09:24:22
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-18 15:47:17
weining1203: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢回复 2012-09-18 17:05:09
引用回帖:
13楼: Originally posted by weining1203 at 2012-09-18 09:24:22
谢谢您的回复，那么pMD19-T适合我的片段吗，是哪家公司的？连接只需5分钟好快啊，看很多都是过夜连接的...

这个载体是宝生物的，适不适合你的片段我不敢断言，不过一般都可以用这个载体来做TA克隆。
需要说明的是这个载体有两种，一种没有多克隆位点（即没有酶切位点）称为simple版本；另一种是常规的，即有多克隆位点的。
用simple vector 的话，在选择酶切位点的时候比较随意，不用考虑载体的因素，我建议你用这个，不过最终还是你自己选择用哪一种。
至于反应时间，说明书上写的是5分钟，但是我们自己做的时候都会把时间延长，也有过夜的。
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14楼2012-09-18 10:24:57
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lihuahan

银虫 (初入文坛)
请问一下如果ORF不完整，CDS序列中含有5段ORF应该怎样做尼？是选取一段还是说直接把他们连起来作为一个完整的ORF？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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15楼2014-05-04 10:32:45
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