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weining1203

新虫 (小有名气)

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9楼: Originally posted by jingdejun at 2012-09-17 16:32:44
我觉得这种情况的话,设计引物的时候可以不加保护碱基,pcr产物连接T载体,连T之后就无所谓有没有保护碱基了。

关于阅读框移码的问题,我们一般设计引物的时候应该尽量避免有ATG的出现,不过即便是有的话,我个人 ...

还想请教您一个问题,我的目的片段2157bp,一个完整的ORF,要先连接T载体,那种T载体好啊,还有选用那家的T4连接酶,谢谢
11楼2012-09-17 17:32:52
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-18 15:47:08
引用回帖:
11楼: Originally posted by weining1203 at 2012-09-17 17:32:52
还想请教您一个问题,我的目的片段2157bp,一个完整的ORF,要先连接T载体,那种T载体好啊,还有选用那家的T4连接酶,谢谢...

T载体不存在哪种好与不好,只有适合不适合。
现在比较常用的有pMD19-T和pMD20-T。
试剂盒里面自带的有buffer(solution I),不需要自己再买连接酶,只需要算好自己的插入片段的浓度,按照说明书加样,反应只需要5分钟(一般不按照这个时间来)就可以完成。

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12楼2012-09-17 22:44:27
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weining1203

新虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by jingdejun at 2012-09-17 22:44:27
T载体不存在哪种好与不好,只有适合不适合。
现在比较常用的有pMD19-T和pMD20-T。
试剂盒里面自带的有buffer(solution I),不需要自己再买连接酶,只需要算好自己的插入片段的浓度,按照说明书加样,反应只需要 ...

谢谢您的回复,那么pMD19-T适合我的片段吗,是哪家公司的?连接只需5分钟好快啊,看很多都是过夜连接的
13楼2012-09-18 09:24:22
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-18 15:47:17
weining1203: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢回复 2012-09-18 17:05:09
引用回帖:
13楼: Originally posted by weining1203 at 2012-09-18 09:24:22
谢谢您的回复,那么pMD19-T适合我的片段吗,是哪家公司的?连接只需5分钟好快啊,看很多都是过夜连接的...

这个载体是宝生物的,适不适合你的片段我不敢断言,不过一般都可以用这个载体来做TA克隆。
需要说明的是这个载体有两种,一种没有多克隆位点(即没有酶切位点)称为simple版本;另一种是常规的,即有多克隆位点的。
用simple vector 的话,在选择酶切位点的时候比较随意,不用考虑载体的因素,我建议你用这个,不过最终还是你自己选择用哪一种。
至于反应时间,说明书上写的是5分钟,但是我们自己做的时候都会把时间延长,也有过夜的。
14楼2012-09-18 10:24:57
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lihuahan

银虫 (初入文坛)

请问一下如果ORF不完整,CDS序列中含有5段ORF应该怎样做尼?是选取一段还是说直接把他们连起来作为一个完整的ORF?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
15楼2014-05-04 10:32:45
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