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weining1203新虫 (小有名气)
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做原核表达引物设计的有关问题
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克隆了目的基因，含有一个完整的ORF，现在想做原核表达，表达载体为pET-32a，酶切位点选择SacI和XhoI，现有如下问题想请教大家： 1 是不是直接把酶切位点放在引物的5端 2 加什么样的保护碱基 3 加上酶切位点和保护碱基后在表达蛋白时会不会引起阅读框发生错位使得蛋白不能表达或表达的蛋白与预期的不同，若阅读框发生错位，应该怎么设计引物。 本人是新手，很多问题都不清楚，求大神详细解答。 附：克隆引物，上游 5-ATGGTTGCAGCAGCAGAAAT-3 下游 5-TCAGAATGGGCCAGGAGTTC-3 附件里有pET-32a图谱 |
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2012-09-14 22:19:19, 44.83 K
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jingdejun
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【答案】应助回帖
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-18 15:47:08
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-18 15:47:08
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T载体不存在哪种好与不好，只有适合不适合。 现在比较常用的有pMD19-T和pMD20-T。 试剂盒里面自带的有buffer（solution I），不需要自己再买连接酶，只需要算好自己的插入片段的浓度，按照说明书加样，反应只需要5分钟（一般不按照这个时间来）就可以完成。 |
weining120312楼2012-09-17 22:44:27
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: MolEPI+1, 很好 2012-09-15 08:12:33
1949stone: MolEPI+1, 很好 2012-09-15 08:12:33
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1.先把你的酶切位点加到目的片段上，然后再正常设计引物就可以了。 2.保护碱基有好多种选择，但是加不同的保护碱基会影响你酶切的效率。 3.酶切位点的引入不会改变读码框的位置，因为你酶切之后还是要做连接的，酶切位点会翻译成两个氨基酸。保护碱基不会影响读码框位置，因为它会被酶切掉。 |
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2楼2012-09-14 22:55:03
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+2, 很好的建议 2012-09-15 08:13:30
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+2, 很好的建议 2012-09-15 08:13:30
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建议不加保护碱基，上游直接加酶切位点，下游在互补条带末端加酶切位点，用引物设计软件很方便的，设计，pcr出来的产物直接胶回收连接t载体 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
3楼2012-09-15 00:49:15
weining1203
新虫 (小有名气)
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4楼2012-09-15 08:09:17