应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做原核表达引物设计的有关问题
51/1返回列表
查看: 3382  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] 做原核表达引物设计的有关问题

克隆了目的基因，含有一个完整的ORF，现在想做原核表达，表达载体为pET-32a，酶切位点选择SacI和XhoI，现有如下问题想请教大家：
1 是不是直接把酶切位点放在引物的5端
2 加什么样的保护碱基
3 加上酶切位点和保护碱基后在表达蛋白时会不会引起阅读框发生错位使得蛋白不能表达或表达的蛋白与预期的不同，若阅读框发生错位，应该怎么设计引物。

本人是新手，很多问题都不清楚，求大神详细解答。
附：克隆引物，上游 5-ATGGTTGCAGCAGCAGAAAT-3
                       下游 5-TCAGAATGGGCCAGGAGTTC-3

附件里有pET-32a图谱
回复此楼

» 本帖附件资源列表

  • 欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
    本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com
  • 附件 1 : pET32a原核表达载体.pdf
    • 2012-09-14 22:19:19, 44.83 K

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖 实验操作 【经验-心得】

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-09-14 22:23:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by weining1203 at 2012-09-15 10:51:45
谢谢回复，好像明白一点了，连完T载体还要连接表达载体pet-32a做表达，不用加保护碱基吗？...

引物设定好了就不能再变了，除非重新设定引物，我建议你设定的引物不加保护碱基

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
有时候，一句话，可以改变未来
8楼2012-09-15 11:30:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

ybs007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1949stone: MolEPI+1, 很好 2012-09-15 08:12:33
1.先把你的酶切位点加到目的片段上，然后再正常设计引物就可以了。
2.保护碱基有好多种选择，但是加不同的保护碱基会影响你酶切的效率。
3.酶切位点的引入不会改变读码框的位置，因为你酶切之后还是要做连接的，酶切位点会翻译成两个氨基酸。保护碱基不会影响读码框位置，因为它会被酶切掉。
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

weining1203
平生我自知
2楼2012-09-14 22:55:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+2, 很好的建议 2012-09-15 08:13:30
建议不加保护碱基，上游直接加酶切位点，下游在互补条带末端加酶切位点，用引物设计软件很方便的，设计，pcr出来的产物直接胶回收连接t载体

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

weining1203
有时候，一句话，可以改变未来
3楼2012-09-15 00:49:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by ybs007 at 2012-09-14 22:55:03
1.先把你的酶切位点加到目的片段上，然后再正常设计引物就可以了。
2.保护碱基有好多种选择，但是加不同的保护碱基会影响你酶切的效率。
3.酶切位点的引入不会改变读码框的位置，因为你酶切之后还是要做连接的，酶 ...

表达的时候是从载体的ATG开始，还是引物的ATG开始呀，很多帖子说设计引物是要注意不要引起读码框改变，这里不是很懂，怎么避免这个问题啊
赞一下 回复此楼
4楼2012-09-15 08:09:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 化学工程085602 305分求调剂 +10 RichLi_ 2026-03-25 10/500 2026-03-26 02:17 by BruceLiu320
[考研] 289求调剂 +15 硕星赴 2026-03-23 15/750 2026-03-26 02:16 by BruceLiu320
[考研] 北科281学硕材料求调剂 +14 tcxiaoxx 2026-03-20 16/800 2026-03-25 23:14 by peike
[考研] 总分293求调剂 +4 加一一九 2026-03-25 6/300 2026-03-25 22:34 by barlinike
[考研] 308求调剂 +5 墨墨漠 2026-03-25 5/250 2026-03-25 22:19 by 544594351
[考研] 299求调剂 +7 某某某某位 2026-03-21 8/400 2026-03-25 20:34 by 热情沙漠
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:03 by Ainin_
[考研] 各位老师您好：本人初试372分 +5 jj涌77 2026-03-25 6/300 2026-03-25 14:15 by mapenggao
[考研] 材料学硕，求调剂 6+4 糖葫芦888ll 2026-03-22 9/450 2026-03-25 11:19 by greychen00
[考研] 0703化学求调剂 +6 奶油草莓. 2026-03-22 7/350 2026-03-25 10:00 by shangxh
[考研] 求调剂，一志愿:南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕，总分289分 +6 @taotao 2026-03-19 6/300 2026-03-25 08:37 by 木托莫露露
[考研] 材料学求调剂 +6 Stella_Yao 2026-03-20 6/300 2026-03-25 00:37 by baoball
[考研] 资源与环境 调剂申请(333分) +7 holy J 2026-03-21 7/350 2026-03-24 17:24 by xiaohai104
[考研] 341求调剂(一志愿湖南大学070300) +5 番茄头--- 2026-03-22 6/300 2026-03-23 23:45 by Txy@872106
[考研] 一志愿陕师大生物学071000，298分，求调剂 +3 SYA！ 2026-03-23 3/150 2026-03-23 19:09 by macy2011
[论文投稿] 急发核心期刊论文 +3 贤达问津 2026-03-23 5/250 2026-03-23 17:13 by 妹子不好惹
[考研] 接收2026硕士调剂(学硕+专硕) +4 allen-yin 2026-03-23 6/300 2026-03-23 15:04 by 汪！？！
[考研] 303求调剂 +5 安忆灵 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:46 by 素颜倾城1988
[考研] 材料学硕301分求调剂 +7 Liyouyumairs 2026-03-21 7/350 2026-03-21 22:31 by peike
[考研] 330求调剂0854 +3 assdll 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:01 by 搏击518
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭