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养活它

新虫 (初入文坛)

[求助] 有谁做过细菌的PCR实验吗?

有谁做过细菌的PCR实验吗?想向各位高手求救一下几个问题:
    现在我做微生物培养(大肠),需要进一步做PCR,我的方法如下:
   开始从冰箱拿到菌源,先进行普通平板活化,然后再挑取疑似菌落进行平板划线,进一步筛选(伊红美兰筛选培养基),然后再进一步做个生化鉴定试验,确定该菌为目的菌。确定目的菌之后,再进行LB培养,测定其OD 600,然后取菌液进行稀释(十个梯度),接着进行倒平板培养、计数(按照国标)。
   1 针对我的方案,麻烦各位专家提点不足之处。
   2 我的方案里面涉及的培养基,有没有不合适的?
   3  方案里的生化试验,从经济、快速、准确来考虑,最好选哪个?
   希望大家多多提出宝贵意见和建议。谢谢!
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
scelab: 金币+5, x谢谢热心交流~ :) 2012-09-13 10:34:36
引用回帖:
5楼: Originally posted by 养活它 at 2012-09-10 21:01:25
你好,谢谢您的帮助,不过我有点不太明白您的意思。
   1 斜面活化
   2 筛选 (具体怎么筛选的?比如金葡菌)
   3 鉴定(PCR测序)
   您的意思是这样吗?...

1活化 我会选择液体活化。
2筛选的话,我觉得一次筛选就行,你上面写得是两步
3 就是鉴定,方法很多,感觉阳性率高的话质粒提取,然后大小正确送去测序即可,阳性率不高,可以菌液PCR,高通量,一次可以挑取四五十个
6楼2012-09-10 21:21:55
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+5, good,很热心的虫子 2012-09-10 17:56:41
实验步骤还可以,第一步活化,然后挑取疑似菌落划线,我觉得不太好,后一步已经有选择培养基了,这一步可以在液体中活化6个小时后,然后筛选,鉴定阶段,可以提质粒然后酶切,或者PCR鉴定,或者直接菌液PCR,我用的方法是,挑取菌落,液体培养6个小时,然后按照PCR一般体系扩增,最后送去测序,一切以测序结果为准。省时的话还是直接菌液PCR,然后测序比较好。
2楼2012-09-10 14:19:34
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
顶 菌液PCR 测序 挺好的
ControlMyself
3楼2012-09-10 16:52:50
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养活它

新虫 (初入文坛)

谢谢你,不过我觉得应该还有些不足,可是不知道那处应该改一下……
4楼2012-09-10 20:44:51
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