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养活它

新虫 (初入文坛)

[求助] 有谁做过细菌的PCR实验吗？

有谁做过细菌的PCR实验吗？想向各位高手求救一下几个问题：
    现在我做微生物培养（大肠），需要进一步做PCR，我的方法如下：
   开始从冰箱拿到菌源，先进行普通平板活化，然后再挑取疑似菌落进行平板划线，进一步筛选（伊红美兰筛选培养基），然后再进一步做个生化鉴定试验，确定该菌为目的菌。确定目的菌之后，再进行LB培养，测定其OD 600,然后取菌液进行稀释（十个梯度），接着进行倒平板培养、计数（按照国标）。
   1 针对我的方案，麻烦各位专家提点不足之处。
   2 我的方案里面涉及的培养基，有没有不合适的？
   3  方案里的生化试验，从经济、快速、准确来考虑，最好选哪个？
   希望大家多多提出宝贵意见和建议。谢谢！
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1楼2012-09-10 12:51:40
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+5, good，很热心的虫子 2012-09-10 17:56:41
实验步骤还可以，第一步活化，然后挑取疑似菌落划线，我觉得不太好，后一步已经有选择培养基了，这一步可以在液体中活化6个小时后，然后筛选，鉴定阶段，可以提质粒然后酶切，或者PCR鉴定，或者直接菌液PCR，我用的方法是，挑取菌落，液体培养6个小时，然后按照PCR一般体系扩增，最后送去测序，一切以测序结果为准。省时的话还是直接菌液PCR，然后测序比较好。
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2楼2012-09-10 14:19:34
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
顶 菌液PCR 测序 挺好的
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ControlMyself
3楼2012-09-10 16:52:50
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养活它

新虫 (初入文坛)
谢谢你，不过我觉得应该还有些不足，可是不知道那处应该改一下……
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4楼2012-09-10 20:44:51
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养活它

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-10 14:19:34
实验步骤还可以，第一步活化，然后挑取疑似菌落划线，我觉得不太好，后一步已经有选择培养基了，这一步可以在液体中活化6个小时后，然后筛选，鉴定阶段，可以提质粒然后酶切，或者PCR鉴定，或者直接菌液PCR，我用的 ...

你好，谢谢您的帮助，不过我有点不太明白您的意思。
   1 斜面活化
   2 筛选 （具体怎么筛选的？比如金葡菌）
   3 鉴定（PCR测序）
   您的意思是这样吗？
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5楼2012-09-10 21:01:25
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
scelab: 金币+5, x谢谢热心交流~ :) 2012-09-13 10:34:36
引用回帖:
5楼: Originally posted by 养活它 at 2012-09-10 21:01:25
你好，谢谢您的帮助，不过我有点不太明白您的意思。
   1 斜面活化
   2 筛选 （具体怎么筛选的？比如金葡菌）
   3 鉴定（PCR测序）
   您的意思是这样吗？...

1活化 我会选择液体活化。
2筛选的话，我觉得一次筛选就行，你上面写得是两步
3 就是鉴定，方法很多，感觉阳性率高的话质粒提取，然后大小正确送去测序即可，阳性率不高，可以菌液PCR，高通量，一次可以挑取四五十个
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6楼2012-09-10 21:21:55
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ybfang

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
scelab: 金币+5, x谢谢热心交流~ :) 2012-09-13 10:34:54
内容已删除
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共勉！！！！
7楼2012-09-10 23:25:39
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wt3532

木虫 (著名写手)

涛声依旧

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
scelab: 金币+5, x谢谢热心交流~ :) 2012-09-13 10:35:47
没说明为什么用伊红美兰培养基，如果细菌有质粒，直接用质粒上带的抗生素抗性基因筛选（注意活化时间）或者蓝白斑筛选，跳取疑似单菌落，小规模试管（抗生素）摇菌提取质粒电泳鉴定。也可以在平板上大规模挑取单菌落做菌落PCR。
还有不明白你进行菌落计数是什么意思，如果测定细菌生长曲线之类的直接测定OD600或者菌体湿重就可以了
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8楼2012-09-13 10:25:55
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