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马龙sweeting

木虫 (正式写手)

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[交流] RT-PCR时GAPDH条带不一样，目的条带呈涂抹的模糊带如何改进~~

最近在做RT-PCR，可是总是发现GAPDH跑出来不一样~~有时候跑得更是一个有一个没有，请问这是怎么回事~~如何改进呢~~
还有我的目的条带总是出现涂抹状的模糊带，看上去有东西，但是不知道如何改进才行~~请各位高手帮帮忙~~谢谢~~

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1楼 2012-09-07 11:12:18

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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

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★ ★ ★
马龙sweeting(金币+1): 谢谢参与
wizardfan: 金币+2, 回答地很详细 2012-09-09 07:36:08

RT-PCR影响因素多了，最主要的还是原料-RNA质量要好，包括浓度以及完整性，这个最好通过RNA变性胶结合OD260/OD280判断；其次操作过程中的试剂质量要有保障，主要是反转酶以及聚合酶；再次实验过程中的个人操作规范问题，例如移液器加样准确否，有时候打完液体后靠一下EP管壁有时候不靠可能就会产生误差，有时候tip里面的液体打不干净影响更大；最后还是仪器的稳定性，特别是控温等；当然还有很关键的就是引物特异性问题等。总之RT-PCR的影响因素很多，出了问题要一个一个的回查。