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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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qiaolinkun

银虫 (小有名气)

[求助] 菌种鉴定的问题

本人刚刚开始做微生物菌种鉴定,把细菌总DNA提取出来后PCR 胶回收 获得纯16SDNA 可以直接测序么?为什么还要转到感受态细胞(一口爱DH5α)里去筛选阳性菌呢?两者测序结果会有多大差异?
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雨伞

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
qiaolinkun: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2012-08-20 07:06:07
zhang8826857: 金币+1, MicEPI+1, lz给了这么高的评价,授予epi一枚 2012-08-22 16:03:09
直接和你说吧,测序的原理你自己要弄清楚!找书看吧,测序公司拿回去也是和你做PCR的原理差不多。PCR产物测序易出现双峰,所以你的试剂和PCR操作一定要过关,有杂菌污染测序结果可能就会出问题了,但是,操作过关看一个大概结果也可以将PCR产物直接测序,只是测得的前几十个碱基是不准确的。而做一个克隆就不会出现这些问题,一个载体一般连一个PCR片段,一个转化子只能含有一个这样含目的片段的载体(同种质粒不相容),挑单菌落测序应该测的单一结果的,而且这样测序你用的是载体上的引物测序,而非16S引物,这样得到了完整而准确的16S序列。
6楼2012-08-20 00:44:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ybfang

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
qiaolinkun: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-08-20 07:05:58
提取DNA后,PCR反应体系:MIX25ul,超纯水21ul,模版2ul,引物8f和1492r各1ul。跑16S。然后取4ul跑电泳看是否明显条带,若比较亮比较清晰,就可以将剩余的PCR未纯化产物拿去测序了。
共勉!!!!
4楼2012-08-19 23:21:04
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普通回帖

yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-19 20:07:31
qiaolinkun: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-08-20 07:05:38
割胶回收的产物是可以直接拿去测序的,就是在运输的过程中需要加冰袋;要是你们实验室有专门的测序仪的话就不用了啊!
2楼2012-08-19 20:00:48
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qiaolinkun

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yesucao at 2012-08-19 20:00:48
割胶回收的产物是可以直接拿去测序的,就是在运输的过程中需要加冰袋;要是你们实验室有专门的测序仪的话就不用了啊!

我们是送给公司测序的~但我们实验要求是把目的基因转到感受态细胞里培养后筛选出阳性菌再送去检测~~是多此一举?还是更加保险?
3楼2012-08-19 20:50:33
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ybfang

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

转到感受态细胞然后筛选是为了检验你的目标基因是否已经连接到载体
共勉!!!!
5楼2012-08-19 23:28:36
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yesucao

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by qiaolinkun at 2012-08-19 20:50:33
我们是送给公司测序的~但我们实验要求是把目的基因转到感受态细胞里培养后筛选出阳性菌再送去检测~~是多此一举?还是更加保险?...

1、如果只是单纯的做16S鉴定的话,都是可以的;要是转了感受态的话,阳性转化子送去测序,之后的东西也没用了;
2、要是克隆构建的话,就要转大肠的感受态了,阳性菌一部分送去测序,一部分提取质粒,用于后期的酶切和连接用。
7楼2012-08-20 09:53:43
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xyxthq

铁虫 (初入文坛)

5楼的回复很全面
8楼2012-08-21 09:09:57
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wanglei512

金虫 (正式写手)

没必要,直接PCR产物送去测序就行。
9楼2012-08-21 22:02:37
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sjfty

铜虫 (小有名气)

转到感受态更保险些,直接测序也行,要保证够纯
10楼2013-03-19 15:56:12
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