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loop00木虫 (小有名气)
阿凡达
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[求助]
ELISA 显色液空白OD偏高，P/N偏小，是否可以每孔OD减去显色液对照的值?
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间接ELISA做了棋盘法筛选条件，最佳抗原和一抗浓度下阳性血清值1.0，阴性血清值0.14。我用的TMB显色，双波长测定，空气空白OD均值0.02。空气空白孔不加抗原、抗体，只加TMB显色液，TMB OD均值0.12。 目前我的最佳P/N值在6.0，我认为偏低，隔壁师兄其他实验阳性1.0，阴性都在0.1以下，P/N约12。我认为我的实验结果表明封闭、抗体浓度、洗涤问题都不大，关键是TMB质量有问题，TMB显色液空白本底过高，影响我的P/N. 问题：我的TMB空白OD值正常吗？各位有经验的前辈TMB空白多少？ 我可以用我的阴阳性血清OD扣除TMB空白OD再分析实验结果吗？ 怎样才能减小TMB空白的值？避光？重配？买现成的TMB？ 另：比最佳浓度更高的抗原稀释度上，阳性血清OD2.6，阴性0.65，是否是显色时间太长，我应该在做Chessboard棋盘的时候把这一排抗原浓度提前终止？（不同浓度使用不同TMB显色时间）如果看到抗原梯度上阳性孔的值都在1.0左右，论文审稿人会有什么意见呢？ 另：如有详尽专业的解释，大家都好评的，另赠5金币，写技术贴不容易  [ Last edited by wizardfan on 2012-8-24 at 05:36 ] |
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TMB空白值0.12算正常吧，不是很高，第一点就0.06左右，但是一般都是要扣本底的啊。 关于显色时间，就看你的值在那段是最佳的了，都是可以调整的啊，我们一般是620nm读值在0.6-0.7左右终止，终止完大概1.5-1.8之间吧。 还有，TMB是可以稀释的，呵呵，你可以试下稀释后上板，及时显色时间会延长。 |
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