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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » ELISA 显色液空白OD偏高，P/N偏小，是否可以每孔OD减去显色液对照的值?
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loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达

[求助] ELISA 显色液空白OD偏高，P/N偏小，是否可以每孔OD减去显色液对照的值?

间接ELISA做了棋盘法筛选条件，最佳抗原和一抗浓度下阳性血清值1.0，阴性血清值0.14。我用的TMB显色，双波长测定，空气空白OD均值0.02。空气空白孔不加抗原、抗体，只加TMB显色液，TMB OD均值0.12。
目前我的最佳P/N值在6.0，我认为偏低，隔壁师兄其他实验阳性1.0，阴性都在0.1以下，P/N约12。我认为我的实验结果表明封闭、抗体浓度、洗涤问题都不大，关键是TMB质量有问题，TMB显色液空白本底过高，影响我的P/N.

问题：我的TMB空白OD值正常吗？各位有经验的前辈TMB空白多少？
           我可以用我的阴阳性血清OD扣除TMB空白OD再分析实验结果吗？
           怎样才能减小TMB空白的值？避光？重配？买现成的TMB？
另：比最佳浓度更高的抗原稀释度上，阳性血清OD2.6，阴性0.65，是否是显色时间太长，我应该在做Chessboard棋盘的时候把这一排抗原浓度提前终止？（不同浓度使用不同TMB显色时间）如果看到抗原梯度上阳性孔的值都在1.0左右，论文审稿人会有什么意见呢？

另：如有详尽专业的解释，大家都好评的，另赠5金币，写技术贴不容易

[ Last edited by wizardfan on 2012-8-24 at 05:36 ]
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坚强面对生活
1楼 2012-08-16 12:03:48
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loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达
wizardfan: 应要求，已改内容，并用红色字体显示 2012-08-24 05:38:00
谢谢版主。不好意思我的问题写错了，我的阴性对照OD是0.14左右，不是1.4
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坚强面对生活
2楼2012-08-16 13:41:04
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飞儿豆豆

金虫 (小有名气)
太专业了，，没做过，顶下吧~
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做我所做，想我所想，尽我所能~
3楼2012-08-18 13:55:46
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ppsfxn

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
loop00: 金币+2, ★有帮助 2012-08-23 18:33:16
wizardfan: 金币+3, 谢谢分享经验，继续保持 2012-08-24 05:38:37
loop00: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-09-07 06:12:05
TMB空白值0.12算正常吧，不是很高，第一点就0.06左右，但是一般都是要扣本底的啊。
关于显色时间，就看你的值在那段是最佳的了，都是可以调整的啊，我们一般是620nm读值在0.6-0.7左右终止，终止完大概1.5-1.8之间吧。
还有，TMB是可以稀释的，呵呵，你可以试下稀释后上板，及时显色时间会延长。
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4楼2012-08-18 21:43:15
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yyk81

木虫 (正式写手)
标记一下!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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学无止境！
5楼2012-08-23 17:16:08
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loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达
引用回帖:
4楼: Originally posted by ppsfxn at 2012-08-18 21:43:15
TMB空白值0.12算正常吧，不是很高，第一点就0.06左右，但是一般都是要扣本底的啊。
关于显色时间，就看你的值在那段是最佳的了，都是可以调整的啊，我们一般是620nm读值在0.6-0.7左右终止，终止完大概1.5-1.8之间吧 ...

谢谢，你做棋盘的时候不同样孔之间TMB显色时间相同吗？
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坚强面对生活
6楼2012-08-23 18:34:02
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