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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 由谁用过pcDNA™3.1 Directional TOPO®载体吗
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zhanglixuan

铜虫 (小有名气)

[交流] 由谁用过pcDNA™3.1 Directional TOPO®载体吗已有3人参与

我最近把一个长度为1818bp的基因连接到pcDNA™3.1 Directional TOPO®载体上连接20微升体系，全部转入top10感受态细胞中转化后氨苄板上长了大概100个左右的单克隆，阴性对照板上没长菌落，我挑取了24个单克隆做pcr鉴定全是阴性的我想问一下这个载体的假阳性率是不是特别高？还有就是我应该怎样在继续下一步的实验
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1楼2012-08-09 15:46:01
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zhanglixuan

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 山轻水秀 at 2012-08-09 15:48:31
我最近也在用这个载体，哇，测序全是阴性的，你的结论似乎正确。最近正试图改变连接比例来看看吧，希望我们都早日连上

首先：感谢您的回复
其次：改变连接比例能行吗？你连接多长时间？上次我连接了1个小时，是不是连接时间太长了造成的这样的结果。还有就是能通过别的方法筛选吗？这家阳性率也太高了
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3楼2012-08-10 10:19:11
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山轻水秀

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我最近也在用这个载体，哇，测序全是阴性的，你的结论似乎正确。最近正试图改变连接比例来看看吧，希望我们都早日连上
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万变不离其宗，以明确的计划，灵活的方法，创造属于自己的天地
2楼2012-08-09 15:48:31
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山轻水秀

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhanglixuan at 2012-08-10 10:19:11
首先：感谢您的回复
其次：改变连接比例能行吗？你连接多长时间？上次我连接了1个小时，是不是连接时间太长了造成的这样的结果。还有就是能通过别的方法筛选吗？这家阳性率也太高了...

绝对不是你连接时间长，我平常连2小时，我这的老师经常连3小时，网上很多前辈们有很多4度过夜呢。再想想其他办法吧。似乎没有别的方法筛选了吧，抗性一般挺直观的
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万变不离其宗，以明确的计划，灵活的方法，创造属于自己的天地
4楼2012-08-10 15:01:44
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zhanglixuan

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 山轻水秀 at 2012-08-10 15:01:44
绝对不是你连接时间长，我平常连2小时，我这的老师经常连3小时，网上很多前辈们有很多4度过夜呢。再想想其他办法吧。似乎没有别的方法筛选了吧，抗性一般挺直观的...

谢谢啦！感觉这个载体太不靠?≡偈砸幌掳桑Ｍ颐嵌寄芫】煺业窖粜钥寺　�
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5楼2012-08-13 10:38:01
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