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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 湿地植物根际土壤微生物总DNA提取
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vaivaiann

铜虫 (小有名气)

[交流] 湿地植物根际土壤微生物总DNA提取

最近在提取湿地土壤微生物总ＤＮＡ提取，参考文献后想用以下步骤：称取土壤 0. 25g 至 2mL Eppendorf 管中, 用1mL pH8. 0 的PBS 缓冲液洗涤2 次。加入玻璃珠0. 5g 和 1mL 裂解液( CTAB 5% , SDS 1%, EDTA0. 1mol/ L, N aCl 0. 1mo l/ L, pH 8. 0) , 轻微振荡混合均匀后旋涡振荡2min; 10000g 离心1min,吸取上清液,加入NH4Ac至浓度2.5M,混合均匀4 ℃ 保温30min; 10000   g 离心 5min, 小心吸取上清液至干净的 1. 5mL Eppendorf 管中, 加入等体积异丙醇, -20℃ 保温 30min, 10000g 离心 5min, 弃上清,用 pH8. 0 的T E 溶液200微升 溶解沉淀物; DNA溶液用葡聚糖凝胶 Sephadex G75 柱层析纯化-20℃ 保存。
希望熟知ＤＮＡ提取的大侠帮忙看一下，这个步骤中NH4Ac和异丙醇的作用是什么，据我了解到的他们都有沉淀DNA的作用，那“加入NH4Ac至浓度2.5M,混合均匀4 ℃ 保温30min; 10000   g 离心 5min, 小心吸取上清液至干净的 1. 5mL Eppendorf 管中”这一步不就把ＤＮＡ都丢弃了吗？
求助了，求助了～～～
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1楼 2012-08-06 10:35:32
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vaivaiann

铜虫 (小有名气)
提取之后想建基因文库，并且也要进行T-RFLP分析
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3楼2012-08-08 17:18:48
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dodoxxc

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不知道你提土壤总dna的目的是啥，之前我们也试过一些方法，都不理想，后来还是用的试剂盒，算下来每个样品也没多贵，关键是节省了时间，提高了效率
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2楼2012-08-08 10:50:22
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wangshuswfu

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by vaivaiann at 2012-08-08 17:18:48
提取之后想建基因文库，并且也要进行T-RFLP分析

哪里的湿地？我也在做哦~上海还是内蒙古？
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4楼2012-08-08 19:44:13
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vaivaiann

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wangshuswfu at 2012-08-08 19:44:13
哪里的湿地？我也在做哦~上海还是内蒙古？...

我做得是北京的湿地，T-rflp怎么闭光操作的呢，我一直想不明白。见光对它的影响有多大？我是一点经验都没有啊，望指教。
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6楼2012-08-13 21:40:56
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