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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » SDS高盐法提取土壤微生物——求教各位批评指正
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lilylove170

新虫 (小有名气)

[求助] SDS高盐法提取土壤微生物——求教各位批评指正

备注：
该方法是参照一个河南师范大学的硕士论文进行的
疑问：
实验进行至步骤 ④后，离心完了，上层出现一层白色的药片状层面
实验进行至步骤 ⑤后，上层为氯仿，下层为牛奶状的乳状溶液，并没有得到上清
这是什么原因呢，苦苦跪求，谢谢！

具体方法为——参照周集中的SDS裂解法[179]，并作改良。具体如下：
① 取适量活性污泥样品于1.5 ml灭菌离心管中，12000 rpm离心10 min，弃上清，
得样品湿重50~100 mg；
② 用1.5 ml磷酸缓冲液（0.1M，pH 8.0）洗涤样品2~3次；
③ 弃上清，加入约800μl DNA提取液重悬，并加入约90μl 20%SDS水溶液，混
匀，65℃水浴2 h，每隔15~20 min上下颠倒几次；
④ 室温6000 rpm离心10 min，弃上清（应该是取上清吧）；
⑤ 加入等体积PCI溶液（酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1），混匀，静置3~5min，于
室温6000 rpm离心10 min，弃上清（也应该是取上清吧），重复2~3次直到蛋白质层消失为止；
⑥ 加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，4℃过夜（3个小时以上也可以）；
⑦ 在4℃条件下，12000 rpm离心15~30 min，回收DNA；
⑧ 弃上清，加入70%乙醇洗涤，4℃、12000 rpm离心3~5 min，弃上清，风干DNA，
无酒精味为止；
⑨ 用TE缓冲液约50μl溶解DNA，-20℃保存；
⑩ 用1％琼脂糖凝胶电泳检查DNA片段。

左侧为步骤 ⑤后情况，右侧为左侧去上层，加苯酚离心后状况，下层变澄清～～～

[ Last edited by lilylove170 on 2012-6-11 at 17:32 ]
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1楼 2012-06-11 17:03:25
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
取上清，提高转速，12000rpm以上。另外，像是有腐殖酸之类的东西，应该使用相应的试剂去除腐殖酸。没有可以使用的试剂盒么？
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相信自己
2楼2012-06-11 18:48:18
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lilylove170

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2012-06-11 18:48:18
取上清，提高转速，12000rpm以上。另外，像是有腐殖酸之类的东西，应该使用相应的试剂去除腐殖酸。没有可以使用的试剂盒么？

您看看我的拍的照片哈，根本就没有上清，下层是水相，上层是苯酚，这是怎么回事哈，那个方法本身没有问题吧，呵呵，谢谢啦！
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3楼2012-06-11 19:09:26
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lilylove170

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2012-06-11 18:48:18
取上清，提高转速，12000rpm以上。另外，像是有腐殖酸之类的东西，应该使用相应的试剂去除腐殖酸。没有可以使用的试剂盒么？

另外，我这个是个混合菌群来自土壤的，已经被转接几次了，所以，不担心有腐殖质等物质～～～试剂盒买不起，另外，很多评价说，试剂盒效果不如手提，我的是真菌与细菌的混合体，里面有霉菌，也有酵母，枯草之类的杆菌等
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4楼2012-06-11 19:11:00
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by lilylove170 at 2012-06-11 19:11:00
另外，我这个是个混合菌群来自土壤的，已经被转接几次了，所以，不担心有腐殖质等物质～～～试剂盒买不起，另外，很多评价说，试剂盒效果不如手提，我的是真菌与细菌的混合体，里面有霉菌，也有酵母，枯草之类的杆 ...

把离心的转速提高试试。我是说方法里，你改的去上清是正确的、
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相信自己
5楼2012-06-12 08:19:01
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
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3楼: Originally posted by lilylove170 at 2012-06-11 19:09:26
您看看我的拍的照片哈，根本就没有上清，下层是水相，上层是苯酚，这是怎么回事哈，那个方法本身没有问题吧，呵呵，谢谢啦！...

一般是盐浓度过高的情况下,变成水层在下面,有机层在上面,检查一下DNA提取液有没有配错,另外,如果是样品含盐高的原因,建议减少样品的量或者加大提取体积.
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为什么
6楼2012-06-12 09:26:09
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lilylove170

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 547star at 2012-06-12 09:26:09
一般是盐浓度过高的情况下,变成水层在下面,有机层在上面,检查一下DNA提取液有没有配错,另外,如果是样品含盐高的原因,建议减少样品的量或者加大提取体积....

DNA提取液：100 mM Tris-HCl(pH 8.0)，100 mM Phosphate buffer(pH 8.0)，100mM Sodium EDTA(pH 8.0)，1.5 M NaCl，2%CTAB。121℃灭菌20 min，室温保存。

麻烦您帮看看这个配方可以吗，这是原始配方，是不是NaCl的浓度太高了啊？
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7楼2012-06-14 19:13:54
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by lilylove170 at 2012-06-14 19:13:54
DNA提取液：100 mM Tris-HCl(pH 8.0)，100 mM Phosphate buffer(pH 8.0)，100mM Sodium EDTA(pH 8.0)，1.5 M NaCl，2%CTAB。121℃灭菌20 min，室温保存。

麻烦您帮看看这个配方可以吗，这是原始配方，是不是NaC ...

不知道你的这个方法针对污泥改良了哪些地方,我找了采用这个提取液的一个方法,见http://wenku.baidu.com/view/00476edace2f0066f5332242.html,第8页方法三.方法三看起来更合理,你也可以参考了试试，这个方法加酶步骤中,前期溶菌酶起作用比较大,加了SDS后,与蛋白酶K一起发挥破胞的作用，前期高盐保证CTAB（结合了核酸）保持溶解，酚氯仿抽提后，加TE使盐浓度降低（应该再加多一点TE会更好），使得核酸从CTAB上解离以便醇沉淀。
不过，我觉得污泥应该参考一下土壤提取DNA的方法，一般都采用加PVP的步骤，你可以招来参考一下。
你用的方法可以考虑加SDS前加10ul蛋白酶k再温浴，之后的离心取上清，小心点不要把沉淀也吸过来，宁可少取一点。
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为什么
8楼2012-06-14 20:14:06
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