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平端 影响连接吗
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| 本人原核表达载体构建总是连接不上，会不会是因为酶切位点EcoR V的断口是平末端？？？ |
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scutphoenix
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【答案】应助回帖
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一般来说，克隆不成功的原因是载体或外援片段处理不好。常见的情况有两种： 1. 质粒DNA的质量不好，导致载体处理不完全（大量的单切或未酶切载体），连接时出现大量的载体自连，形成大量的背景克隆 2.外源基因片段酶切不好，导致外源基因片段无法连入载体。常见的错误是总担心PCR片段不够，酶切时PCR产物用量太多。事实上，一般由于PCR产物分子量小，完全酶切PCR产物需要的酶量将切同样量的载体DNA所需的酶量多得多。一般来说，PCR产物酶切时，用300--500ng的DNA就足够用了。 关于双酶切设计的问题，可以利用一个在线的双酶切软件double digestion disigner ，我以前在小木虫推荐过，当时免费，现在可能收费了，但仍然可以申请免费使用。 利用该软件进行酶量的精确计算，不用担心酶量是否足够的问题。 |
6楼2012-07-25 20:54:46
7楼2012-07-25 21:46:26
scutphoenix
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