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芥末猫

银虫 (小有名气)

[求助] 平端 影响连接吗

本人原核表达载体构建总是连接不上，会不会是因为酶切位点EcoR V的断口是平末端？？？
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1楼 2012-07-25 14:53:21
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scutphoenix

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-25 20:05:09
这个是TA克隆用的那个酶切点啊，不是平末端呀。
另外现在有很多做平末端连接的kit，好像还很适合大片段的。
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2楼2012-07-25 15:08:47
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polepolar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-07-25 20:05:12
EcoRV 的断口确实是平末端，相对来说连接效率低一些。你一直连接不上，可以考虑以下几个原因：
1，载体是否酶切完全，载体的用量不要太多，酶切时间要足够。
2，载体和目的片断胶回收后鉴定一下浓度，确定有足够的量。
3，连接体系中载体和目的片断的比例是否合适，通常载体与目的片断的mol比为1:3比较好。
4,感受态细胞的效率是不是足够好。
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北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
3楼2012-07-25 16:12:24
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by polepolar at 2012-07-25 16:12:24
EcoRV 的断口确实是平末端，相对来说连接效率低一些。你一直连接不上，可以考虑以下几个原因：
1，载体是否酶切完全，载体的用量不要太多，酶切时间要足够。
2，载体和目的片断胶回收后鉴定一下浓度，确定有足够的 ...

那个摩尔比 我按一比十算的 影响会那么大吗？
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4楼2012-07-25 17:24:35
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-26 15:20:57
建议考虑载体与目的片度比，不过楼主说应该是载体:目的片段=1:10吧，我们实验室一直是这样做了，木有什么问题，请确认酶切片段大小是否正常，是否正确，胶回收后，片段的OD260/280是否正常。还有连接酶，感受态等一些问题。个人看法，希望对你有帮助。
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5楼2012-07-25 18:20:32
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-26 15:21:17
一般来说，克隆不成功的原因是载体或外援片段处理不好。常见的情况有两种：
1. 质粒DNA的质量不好，导致载体处理不完全（大量的单切或未酶切载体），连接时出现大量的载体自连，形成大量的背景克隆
2.外源基因片段酶切不好，导致外源基因片段无法连入载体。常见的错误是总担心PCR片段不够，酶切时PCR产物用量太多。事实上，一般由于PCR产物分子量小，完全酶切PCR产物需要的酶量将切同样量的载体DNA所需的酶量多得多。一般来说，PCR产物酶切时，用300--500ng的DNA就足够用了。
关于双酶切设计的问题，可以利用一个在线的双酶切软件double digestion disigner ，我以前在小木虫推荐过，当时免费，现在可能收费了，但仍然可以申请免费使用。
利用该软件进行酶量的精确计算，不用担心酶量是否足够的问题。
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6楼2012-07-25 20:54:46
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by scutphoenix at 2012-07-25 15:08:47
这个是TA克隆用的那个酶切点啊，不是平末端呀。
另外现在有很多做平末端连接的kit，好像还很适合大片段的。

你好，我想问下，TA克隆用的那个酶切点EcoR V，那我用带有EcoR V酶切位点的引物扩增我的目的片段，再连T载体的话，会不会有影响??
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7楼2012-07-25 21:46:26
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scutphoenix

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

没有关系呀，T载体上已经没有其他的EcoRV的酶切位点了呀。
另外，你可以把你设想好的重组载体去分析下看看，除了你设计的以外，有没有多余的位点嘛，应该是没有的。
以防万一，看一看还是比较好。
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8楼2012-07-26 22:11:16
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lixilei1314

金虫 (小有名气)
请问你现在这个连接上了吗？我最近也老是连接不上，做了好多次了。
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9楼2012-08-27 08:53:26
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