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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平端 影响连接吗
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芥末猫

银虫 (小有名气)

[求助] 平端 影响连接吗

本人原核表达载体构建总是连接不上，会不会是因为酶切位点EcoR V的断口是平末端？？？
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1楼 2012-07-25 14:53:21
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-26 15:21:17
一般来说，克隆不成功的原因是载体或外援片段处理不好。常见的情况有两种：
1. 质粒DNA的质量不好，导致载体处理不完全（大量的单切或未酶切载体），连接时出现大量的载体自连，形成大量的背景克隆
2.外源基因片段酶切不好，导致外源基因片段无法连入载体。常见的错误是总担心PCR片段不够，酶切时PCR产物用量太多。事实上，一般由于PCR产物分子量小，完全酶切PCR产物需要的酶量将切同样量的载体DNA所需的酶量多得多。一般来说，PCR产物酶切时，用300--500ng的DNA就足够用了。
关于双酶切设计的问题，可以利用一个在线的双酶切软件double digestion disigner ，我以前在小木虫推荐过，当时免费，现在可能收费了，但仍然可以申请免费使用。
利用该软件进行酶量的精确计算，不用担心酶量是否足够的问题。
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6楼2012-07-25 20:54:46
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scutphoenix

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-25 20:05:09
这个是TA克隆用的那个酶切点啊，不是平末端呀。
另外现在有很多做平末端连接的kit，好像还很适合大片段的。
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2楼2012-07-25 15:08:47
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polepolar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-07-25 20:05:12
EcoRV 的断口确实是平末端，相对来说连接效率低一些。你一直连接不上，可以考虑以下几个原因：
1，载体是否酶切完全，载体的用量不要太多，酶切时间要足够。
2，载体和目的片断胶回收后鉴定一下浓度，确定有足够的量。
3，连接体系中载体和目的片断的比例是否合适，通常载体与目的片断的mol比为1:3比较好。
4,感受态细胞的效率是不是足够好。
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北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
3楼2012-07-25 16:12:24
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by polepolar at 2012-07-25 16:12:24
EcoRV 的断口确实是平末端，相对来说连接效率低一些。你一直连接不上，可以考虑以下几个原因：
1，载体是否酶切完全，载体的用量不要太多，酶切时间要足够。
2，载体和目的片断胶回收后鉴定一下浓度，确定有足够的 ...

那个摩尔比 我按一比十算的 影响会那么大吗？
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4楼2012-07-25 17:24:35
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