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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平端 影响连接吗
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芥末猫

银虫 (小有名气)

[求助] 平端 影响连接吗

本人原核表达载体构建总是连接不上，会不会是因为酶切位点EcoR V的断口是平末端？？？
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1楼 2012-07-25 14:53:21
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polepolar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-07-25 20:05:12
EcoRV 的断口确实是平末端，相对来说连接效率低一些。你一直连接不上，可以考虑以下几个原因：
1，载体是否酶切完全，载体的用量不要太多，酶切时间要足够。
2，载体和目的片断胶回收后鉴定一下浓度，确定有足够的量。
3，连接体系中载体和目的片断的比例是否合适，通常载体与目的片断的mol比为1:3比较好。
4,感受态细胞的效率是不是足够好。
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北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
3楼2012-07-25 16:12:24
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scutphoenix

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-25 20:05:09
这个是TA克隆用的那个酶切点啊，不是平末端呀。
另外现在有很多做平末端连接的kit，好像还很适合大片段的。
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2楼2012-07-25 15:08:47
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by polepolar at 2012-07-25 16:12:24
EcoRV 的断口确实是平末端，相对来说连接效率低一些。你一直连接不上，可以考虑以下几个原因：
1，载体是否酶切完全，载体的用量不要太多，酶切时间要足够。
2，载体和目的片断胶回收后鉴定一下浓度，确定有足够的 ...

那个摩尔比 我按一比十算的 影响会那么大吗？
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4楼2012-07-25 17:24:35
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-26 15:20:57
建议考虑载体与目的片度比，不过楼主说应该是载体:目的片段=1:10吧，我们实验室一直是这样做了，木有什么问题，请确认酶切片段大小是否正常，是否正确，胶回收后，片段的OD260/280是否正常。还有连接酶，感受态等一些问题。个人看法，希望对你有帮助。
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5楼2012-07-25 18:20:32
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