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chuxuan

铜虫 (正式写手)

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[求助] 新手，引物设计不懂啊。。求介绍啊

1、我从NCBI下了所需要的序列
2、我把序列粘贴到PRIMER5.0
3、到设置那个上游引物跟下游引物长度的时候，不知道该怎么设啊。
还有那个PCR目标产物长度。
我要设计的引物基因在序列【总长2034 bp DNA】的位置是291..899
另外一个的位置是在912..1784
【要设计这两个基因的引物】
还有完了，之后要怎么看到底好不好

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1楼 2012-07-18 16:37:43

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xw19880905

新虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-07-19 15:17:14

引物长度一般在18-25bp左右，如果做定量的话，目标产物长度一般在150bp左右，设计完后软件分析，PCR分析，发夹结构，二聚体，这些软件分析会告诉你的

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2楼2012-07-19 11:42:16

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linchenyu

铁虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

　关于设计siRNA以及siRNA设计对siRNA功能的影响，还没有可靠的规律。虽然可以通过对mRNA实验分析准确的找到一段基因的全部siRNA最佳作用位置，但这个过程十分耗时且昂贵，不推荐常规实验使用。一种做法是每个目标序列设计3－4对siRNAs，实验选择较有效的siRNA。　　siRNA设计大都根据Tuschl的实验，要点如下：　　1.目标基因开放阅读框起始密码下游75至100碱基位置开始，寻找“AA”二连序列后的19个碱基序列。（用非“AA”的“XY”序列后的19个碱基序列同样可以得到很好效果的siRNA）。设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区。　　2.分析获得的序列，选择GC比在40-55%之间的靶基因序列作为优选。　　3.将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST等。　　4.如果选择shRNA，有报道显示9个寡核苷酸的环是最有效的。　　下面是另一个设计的版本，大致相同：　　1. 从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。　　2. 将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST 　　3. 选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。　　负对照　　一个完整的siRNA实验应该有负对照，作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。如果计划合成siRNA，那么可以直接提供以AA打头的21个碱基序列，厂家会合成一对互补的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT结尾，如果要UU结尾的话通常要特别说明。有结果显示，UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别。因为这个突出端无需和靶序列互补。　　现在Qiagen公司的网站上有完整的siRNA 的设计方法，可以自动设计并生成多个备选序列，并且可以自动连接到基因组数据库进行检索比对。

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集思广益，海纳百川

3楼2012-07-19 17:34:51

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linchenyu

铁虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

制备
　　体外制备　　1.化学合成　　许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。　　最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究　　不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素　　2.体外转录　　以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。　　最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。　　不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。　　3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 　　其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。　　dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。　　最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型　　不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗　　体内表达　　前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。　　4. siRNA表达载体　　多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。　　siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。　　病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。　　最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。　　不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。　　5. siRNA表达框架　　siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。　　这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中（晶赛公司的Protocol可以解决这一问题）②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。　　最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子　　不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）

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集思广益，海纳百川

4楼2012-07-19 17:35:48

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