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凤凰城边

银虫 (正式写手)

[求助] soe pcr

最近在做重叠延伸PCR,但是现实是骨感的啊。我用mixture做的pcr,不知是否有影响?两个小片段都能够P出来,但是无法overlap。做overlap的时候我是加入片段1和2约75ng,不知量是多还是少?先做8个 循环之后加入引物,在做25个循环,结果没有连接上。

求购人指点迷津!
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爱拼才会赢
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tianyinghu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
凤凰城边: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-07-13 09:56:21
干嘛先做8个循环呢,直接正常PCR程序就好,模板多加点,加到200ng,不知道你的片段多长,还有叠加PCR接头很重要,不知道你接头多少BP。
2楼2012-07-12 13:04:33
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ranger04

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以试试先用较低退火温度做5-个循环,然后用正常退火温度最最后的循环。模板量似乎没有太大的影响
3楼2012-07-12 13:49:05
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凤凰城边

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by tianyinghu at 2012-07-12 13:04:33
干嘛先做8个循环呢,直接正常PCR程序就好,模板多加点,加到200ng,不知道你的片段多长,还有叠加PCR接头很重要,不知道你接头多少BP。

我的俩个小片段是6oo bp,接头时16个碱基
爱拼才会赢
4楼2012-07-12 15:09:34
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凤凰城边

银虫 (正式写手)

按照普通PCR,结果是有非特异性条带。有点糊的感觉
爱拼才会赢
5楼2012-07-12 20:19:57
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陈年芬芳

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
按照普通PCR程序来吧,我之前做过,退火温度从62一直做到了49,又还再来了一遍,不是不出条带就是模糊,杂带。好在最后条件还是确定了,很折腾。没有必要先做8个循环。各个量也需要自己根据电泳结果来调整。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

6楼2012-07-13 09:06:11
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凤凰城边

银虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 陈年芬芳 at 2012-07-13 09:06:11
按照普通PCR程序来吧,我之前做过,退火温度从62一直做到了49,又还再来了一遍,不是不出条带就是模糊,杂带。好在最后条件还是确定了,很折腾。没有必要先做8个循环。各个量也需要自己根据电泳结果来调整。

谢谢,我会接着试试的!!以后还要向你请教啊!
爱拼才会赢
7楼2012-07-13 09:55:47
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tianyinghu

金虫 (小有名气)

你接头太少了,建议25个以上,这样叠加更保险点,别为了省引物钱,省那点钱,你后面的钱会花的更多。
8楼2012-07-13 11:04:58
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by tianyinghu at 2012-07-13 11:04:58
你接头太少了,建议25个以上,这样叠加更保险点,别为了省引物钱,省那点钱,你后面的钱会花的更多。

你好,请问一下,接头引物一般是怎样设计的呢?根据每段基因设计的各是多少啊?我做的那个是将近40个呢。与两个片段互补的约各20个,是不是太长了,一直没做出来。。。
9楼2012-10-15 18:46:02
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