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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » soe pcr
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凤凰城边

银虫 (正式写手)

[求助] soe pcr

最近在做重叠延伸PCR，但是现实是骨感的啊。我用mixture做的pcr，不知是否有影响？两个小片段都能够P出来，但是无法overlap。做overlap的时候我是加入片段1和2约75ng，不知量是多还是少？先做8个 循环之后加入引物，在做25个循环，结果没有连接上。

求购人指点迷津！
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爱拼才会赢
1楼 2012-07-12 11:27:35
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ranger04

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以试试先用较低退火温度做5-个循环，然后用正常退火温度最最后的循环。模板量似乎没有太大的影响
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3楼2012-07-12 13:49:05
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tianyinghu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
凤凰城边: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-07-13 09:56:21
干嘛先做8个循环呢，直接正常PCR程序就好，模板多加点，加到200ng，不知道你的片段多长，还有叠加PCR接头很重要，不知道你接头多少BP。
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2楼2012-07-12 13:04:33
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凤凰城边

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tianyinghu at 2012-07-12 13:04:33
干嘛先做8个循环呢，直接正常PCR程序就好，模板多加点，加到200ng，不知道你的片段多长，还有叠加PCR接头很重要，不知道你接头多少BP。

我的俩个小片段是6oo bp，接头时16个碱基
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爱拼才会赢
4楼2012-07-12 15:09:34
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凤凰城边

银虫 (正式写手)
按照普通PCR，结果是有非特异性条带。有点糊的感觉
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爱拼才会赢
5楼2012-07-12 20:19:57
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