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凤凰城边

银虫 (正式写手)

[求助] soe pcr

最近在做重叠延伸PCR，但是现实是骨感的啊。我用mixture做的pcr，不知是否有影响？两个小片段都能够P出来，但是无法overlap。做overlap的时候我是加入片段1和2约75ng，不知量是多还是少？先做8个 循环之后加入引物，在做25个循环，结果没有连接上。

求购人指点迷津！
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爱拼才会赢
1楼 2012-07-12 11:27:35
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tianyinghu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
凤凰城边: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-07-13 09:56:21
干嘛先做8个循环呢，直接正常PCR程序就好，模板多加点，加到200ng，不知道你的片段多长，还有叠加PCR接头很重要，不知道你接头多少BP。
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2楼2012-07-12 13:04:33
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ranger04

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以试试先用较低退火温度做5-个循环，然后用正常退火温度最最后的循环。模板量似乎没有太大的影响
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3楼2012-07-12 13:49:05
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凤凰城边

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tianyinghu at 2012-07-12 13:04:33
干嘛先做8个循环呢，直接正常PCR程序就好，模板多加点，加到200ng，不知道你的片段多长，还有叠加PCR接头很重要，不知道你接头多少BP。

我的俩个小片段是6oo bp，接头时16个碱基
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爱拼才会赢
4楼2012-07-12 15:09:34
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凤凰城边

银虫 (正式写手)
按照普通PCR，结果是有非特异性条带。有点糊的感觉
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爱拼才会赢
5楼2012-07-12 20:19:57
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陈年芬芳

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
按照普通PCR程序来吧，我之前做过，退火温度从62一直做到了49，又还再来了一遍，不是不出条带就是模糊，杂带。好在最后条件还是确定了，很折腾。没有必要先做8个循环。各个量也需要自己根据电泳结果来调整。
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凤凰城边
6楼2012-07-13 09:06:11
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凤凰城边

银虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 陈年芬芳 at 2012-07-13 09:06:11
按照普通PCR程序来吧，我之前做过，退火温度从62一直做到了49，又还再来了一遍，不是不出条带就是模糊，杂带。好在最后条件还是确定了，很折腾。没有必要先做8个循环。各个量也需要自己根据电泳结果来调整。

谢谢，我会接着试试的！！以后还要向你请教啊！
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爱拼才会赢
7楼2012-07-13 09:55:47
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tianyinghu

金虫 (小有名气)
你接头太少了，建议25个以上，这样叠加更保险点，别为了省引物钱，省那点钱，你后面的钱会花的更多。
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8楼2012-07-13 11:04:58
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by tianyinghu at 2012-07-13 11:04:58
你接头太少了，建议25个以上，这样叠加更保险点，别为了省引物钱，省那点钱，你后面的钱会花的更多。

你好，请问一下，接头引物一般是怎样设计的呢？根据每段基因设计的各是多少啊？我做的那个是将近40个呢。与两个片段互补的约各20个，是不是太长了，一直没做出来。。。
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9楼2012-10-15 18:46:02
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