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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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凤凰城边

银虫 (正式写手)

[求助] soe pcr

最近在做重叠延伸PCR，但是现实是骨感的啊。我用mixture做的pcr，不知是否有影响？两个小片段都能够P出来，但是无法overlap。做overlap的时候我是加入片段1和2约75ng，不知量是多还是少？先做8个 循环之后加入引物，在做25个循环，结果没有连接上。

求购人指点迷津！
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爱拼才会赢
1楼 2012-07-12 11:27:35
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陈年芬芳

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
按照普通PCR程序来吧，我之前做过，退火温度从62一直做到了49，又还再来了一遍，不是不出条带就是模糊，杂带。好在最后条件还是确定了，很折腾。没有必要先做8个循环。各个量也需要自己根据电泳结果来调整。
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凤凰城边
6楼2012-07-13 09:06:11
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tianyinghu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
凤凰城边: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-07-13 09:56:21
干嘛先做8个循环呢，直接正常PCR程序就好，模板多加点，加到200ng，不知道你的片段多长，还有叠加PCR接头很重要，不知道你接头多少BP。
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2楼2012-07-12 13:04:33
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ranger04

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以试试先用较低退火温度做5-个循环，然后用正常退火温度最最后的循环。模板量似乎没有太大的影响
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3楼2012-07-12 13:49:05
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凤凰城边

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tianyinghu at 2012-07-12 13:04:33
干嘛先做8个循环呢，直接正常PCR程序就好，模板多加点，加到200ng，不知道你的片段多长，还有叠加PCR接头很重要，不知道你接头多少BP。

我的俩个小片段是6oo bp，接头时16个碱基
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爱拼才会赢
4楼2012-07-12 15:09:34
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