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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于ROS(活性氧）测定问题
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yajune

木虫 (职业作家)

[求助] 关于ROS(活性氧）测定问题 已有1人参与

想用用DCFH-DA法测斑马鱼大脑ROS含量，以前没做过，我看文献里基本都是用的荧光酶标仪测的，就是把反应物都加到酶标板里，然后37度反应30min就可以测了，但是我们实验室只有荧光分光光度计，也就是说只能一个样一个样的测。想问一下，用荧光分光度计可以测么，具体怎么操作呢？跪请做过或了解的大神回答一下，谢谢
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1楼 2012-07-05 12:24:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

果子么么茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by hellolin at 2013-04-03 15:08:43
你好，不知道你是否用酶标仪测过细胞内的ROS？用酶标仪测细胞ROS的话最后检测的时候是否需要将细胞裂解后在检测？或者是不用裂解直接吹均匀后加到酶标板里测？另外在用探针孵育是是否可以用有血清的培养基稀释探针 ...

第一个问题  没有！
应该不需要裂解 探针都装载到细胞内了  不需要裂解直接可以检测荧光
最后一个问题 看说明书  上面应该有的
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13楼2013-04-03 21:12:27
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果子么么茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+3, 鼓励交流 2012-07-05 13:42:53
yajune: 金币+5, ★★★很有帮助, 先谢谢哈，那怎么摸索最佳反应时间和最大发射波长？试剂盒里有方法么？ 2012-07-05 13:48:26
荧光分光光度计可以测 详细可以看试剂盒的说明书 用阳性对照先做个预实验 摸索最佳反应时间和最大发射波长  摸索好条件再做正式试验 PS 测试溶液不是均一状态的话 最大峰值会随时间（细胞沉降）而改变 所以操作要迅速才好 还有探针装载之后一定要多洗几遍 洗去未装载入的探针防止背景干扰
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2楼2012-07-05 12:51:30
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yajune

木虫 (职业作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-07-05 12:51:30
荧光分光光度计可以测 详细可以看试剂盒的说明书 用阳性对照先做个预实验 摸索最佳反应时间和最大发射波长  摸索好条件再做正式试验 PS 测试溶液不是均一状态的话 最大峰值会随时间（细胞沉降）而改变 所以操作要迅 ...

谢谢！那摸索条件时，最佳反应时间和最大发射波长是以什么为合适的标准呢？试剂盒里会有说明么？然后就是你说的探针是什么东西？是荧光分管光度计上的东西么？还是ROS试剂盒里有的？（我以前没做过荧光比色的试验。。。）
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3楼2012-07-05 13:51:23
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果子么么茶

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
amisking: 金币+3, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-05 20:38:17
引用回帖:
3楼: Originally posted by yajune at 2012-07-05 13:51:23
谢谢！那摸索条件时，最佳反应时间和最大发射波长是以什么为合适的标准呢？试剂盒里会有说明么？然后就是你说的探针是什么东西？是荧光分管光度计上的东西么？还是ROS试剂盒里有的？（我以前没做过荧光比色的试验。 ...

介个 你难道不是用试剂盒做的吗 我用的试剂盒激发波是488nm 发射波525左右 实验时波长段内扫描下就知道了 探针就是试剂盒里的东西
有的加入活性氧阳性对照试剂Rosup15-20min就可以检测发射荧光 有的要20-30min 具体的研究说明书就可以了

“活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
”
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4楼2012-07-05 15:03:19
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yajune

木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-07-05 15:03:19
介个 你难道不是用试剂盒做的吗 我用的试剂盒激发波是488nm 发射波525左右 实验时波长段内扫描下就知道了 探针就是试剂盒里的东西
有的加入活性氧阳性对照试剂Rosup15-20min就可以检测发射荧光 有的要20-30min 具 ...

谢谢你的耐心解答！我现在正准备买试剂盒，我测的是组织ROS，看一个南京建成的试剂盒说明书是用的荧光酶标仪，但是我这只有分光光度计，测的时候每次只能测一个样，这样每个样的反应（孵育）时间就不一样了，我不知道这会不会有影响。。。目前在纠结这个问题
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5楼2012-07-05 21:05:19
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果子么么茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yajune at 2012-07-05 21:05:19
谢谢你的耐心解答！我现在正准备买试剂盒，我测的是组织ROS，看一个南京建成的试剂盒说明书是用的荧光酶标仪，但是我这只有分光光度计，测的时候每次只能测一个样，这样每个样的反应（孵育）时间就不一样了，我不知 ...

没办法只有一个样池 所以每次测试动作都很迅速 并且做好预实验
没办法 放假中 不然可以拍张说明书传上来
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6楼2012-07-05 21:29:25
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gigiloveu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么不用流式？荧光酶标仪误差比较大 而且用的不广泛。
我也是做ROS的·DCF-DA,DHE什么的，我一直是做流式，最近也开始在摸激光共聚焦的条件。
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7楼2012-07-06 08:42:41
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yajune

木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gigiloveu at 2012-07-06 08:42:41
为什么不用流式？荧光酶标仪误差比较大 而且用的不广泛。
我也是做ROS的·DCF-DA,DHE什么的，我一直是做流式，最近也开始在摸激光共聚焦的条件。

流式没设备啊，而且我觉得荧光酶标仪使用率还行，我看的好多文献都用的这个
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8楼2012-07-08 08:02:32
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e12j

新虫 (小有名气)
请教各位，DCFH-DA在配制和使用上有什么要注意的啊？
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9楼2012-08-01 10:14:54
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shunzhifulin

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yajune at 2012-07-08 08:02:32
流式没设备啊，而且我觉得荧光酶标仪使用率还行，我看的好多文献都用的这个...

楼主，我也要测，流式设备方法具体怎么弄你知道吗？另外，你用测得结果怎么样啊？
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10楼2012-11-18 17:21:04
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