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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 测ROS是否需要固定细胞
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zrn_jane

木虫 (小有名气)

[求助] 测ROS是否需要固定细胞

我在用荧光酶标仪测ROS，为了消除背景荧光，加探针后要洗3遍。用的碧云天的试剂盒，上面说用无血清培养基洗，看了看论坛里面说的，很多人用PBS洗，不知道有什么差别呢？另外，我用的HEK293贴壁不牢，洗3遍后很多细胞会被洗掉，特别是刺激严重的组，死细胞更是被洗掉了。所以导致最后测得control组(没刺激)的荧光强度都要比加药组高很多，但是死细胞多的ROS应该更强才对，这个明显是违背实验结论的呀。后面想到能否加完探针后用4%的多聚甲醛固定细胞，但是发现好像测ROS的没什么这样做的，不知道行不行，请教下各位大侠！另外，好像多聚甲醛是不是不能固定死细胞啊，这样是不是还是有问题啊。苦恼中。。。
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Theuniqueone
1楼 2012-01-08 14:32:56
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
★ ★
看天: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-01 12:16:38
zrn_jane: 回帖置顶 2012-05-01 18:14:31
我没做过这个，我师妹做的是检测细胞内ROS的，用的是流式，不固定的，作用后立即检测，因为活性氧的变化很快。像你的这个酶标的他没做过。
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
6楼2012-04-30 21:35:21
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普通回帖

coolman007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zrn_jane(金币+2): ★有帮助 感谢参与 2012-01-09 18:34:45
配置试剂的时候要用无血清的培养液，洗可以用PBS，贴壁细胞一般不会吸掉的，
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2楼2012-01-09 10:06:58
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zrn_jane

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by coolman007 at 2012-01-09 10:06:58:
配置试剂的时候要用无血清的培养液，洗可以用PBS，贴壁细胞一般不会吸掉的，

HEK293贴壁非常不牢，很容易被洗掉。最主要的问题是加药孔导致的死细胞的ROS含量很高，但是反复洗的时候死细胞浮在上面肯定是被吸掉了，这样非加药孔的正常细胞反而比加药孔的ROS含量高，这很不正常啊。请教一下，你们是怎么处理的呢？谢谢
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Theuniqueone
3楼2012-01-09 18:34:25
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zrn_jane

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by coolman007 at 2012-01-09 10:06:58:
配置试剂的时候要用无血清的培养液，洗可以用PBS，贴壁细胞一般不会吸掉的，

您好！请教一下你们测ROS的时候死细胞洗不洗掉啊？还是要先离心了再测？谢谢
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Theuniqueone
4楼2012-01-11 16:01:09
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cuiyb2016

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+3, 鼓励分享 2012-05-01 12:16:26
与楼主有同样的纠结，我测定ROS最头疼的就是后续的洗涤三遍的操作了，后来就是在一些细节上改进了一下，提高离心转速，延长离心时间，还有就是要严格配平，稍有偏差就会导致离心效果差，去上清的时候尽量用枪吸而不能倒。你根据实际情况再改进改进吧，尽量注意细节。
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5楼2012-04-30 11:01:21
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gigiloveu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zrn_jane: 金币+3, ★有帮助 2012-05-11 11:24:41
不用固定
我的方法：
收集细胞后 PBS洗2次 加探针（dcf或者dhe） 37度孵育  然后可以选择PBS洗一下或者不洗   然后上流式细胞仪检测  或者用共聚焦显微镜检测
赞一下 回复此楼
7楼2012-05-02 11:25:54
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zrn_jane

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gigiloveu at 2012-05-02 11:25:54:
不用固定
我的方法：
收集细胞后 PBS洗2次 加探针（dcf或者dhe） 37度孵育  然后可以选择PBS洗一下或者不洗   然后上流式细胞仪检测  或者用共聚焦显微镜检测

谢谢，已经解决
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Theuniqueone
8楼2012-05-11 11:24:26
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