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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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zrn_jane

木虫 (小有名气)

[求助] 测ROS是否需要固定细胞

我在用荧光酶标仪测ROS,为了消除背景荧光,加探针后要洗3遍。用的碧云天的试剂盒,上面说用无血清培养基洗,看了看论坛里面说的,很多人用PBS洗,不知道有什么差别呢?另外,我用的HEK293贴壁不牢,洗3遍后很多细胞会被洗掉,特别是刺激严重的组,死细胞更是被洗掉了。所以导致最后测得control组(没刺激)的荧光强度都要比加药组高很多,但是死细胞多的ROS应该更强才对,这个明显是违背实验结论的呀。后面想到能否加完探针后用4%的多聚甲醛固定细胞,但是发现好像测ROS的没什么这样做的,不知道行不行,请教下各位大侠!另外,好像多聚甲醛是不是不能固定死细胞啊,这样是不是还是有问题啊。苦恼中。。。
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Theuniqueone
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain

★ ★
看天: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-01 12:16:38
zrn_jane: 回帖置顶 2012-05-01 18:14:31
我没做过这个,我师妹做的是检测细胞内ROS的,用的是流式,不固定的,作用后立即检测,因为活性氧的变化很快。像你的这个酶标的他没做过。
我的路靠我的脚踩出来!!!不走寻常路!!!
6楼2012-04-30 21:35:21
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普通回帖

coolman007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
zrn_jane(金币+2): 有帮助 感谢参与 2012-01-09 18:34:45
配置试剂的时候要用无血清的培养液,洗可以用PBS,贴壁细胞一般不会吸掉的,
2楼2012-01-09 10:06:58
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zrn_jane

木虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by coolman007 at 2012-01-09 10:06:58:
配置试剂的时候要用无血清的培养液,洗可以用PBS,贴壁细胞一般不会吸掉的,

HEK293贴壁非常不牢,很容易被洗掉。最主要的问题是加药孔导致的死细胞的ROS含量很高,但是反复洗的时候死细胞浮在上面肯定是被吸掉了,这样非加药孔的正常细胞反而比加药孔的ROS含量高,这很不正常啊。请教一下,你们是怎么处理的呢?谢谢
Theuniqueone
3楼2012-01-09 18:34:25
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zrn_jane

木虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by coolman007 at 2012-01-09 10:06:58:
配置试剂的时候要用无血清的培养液,洗可以用PBS,贴壁细胞一般不会吸掉的,

您好!请教一下你们测ROS的时候死细胞洗不洗掉啊?还是要先离心了再测?谢谢
Theuniqueone
4楼2012-01-11 16:01:09
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cuiyb2016

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
看天: 金币+3, 鼓励分享 2012-05-01 12:16:26
与楼主有同样的纠结,我测定ROS最头疼的就是后续的洗涤三遍的操作了,后来就是在一些细节上改进了一下,提高离心转速,延长离心时间,还有就是要严格配平,稍有偏差就会导致离心效果差,去上清的时候尽量用枪吸而不能倒。你根据实际情况再改进改进吧,尽量注意细节。
5楼2012-04-30 11:01:21
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gigiloveu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zrn_jane: 金币+3, 有帮助 2012-05-11 11:24:41
不用固定
我的方法:
收集细胞后 PBS洗2次 加探针(dcf或者dhe) 37度孵育  然后可以选择PBS洗一下或者不洗   然后上流式细胞仪检测  或者用共聚焦显微镜检测
7楼2012-05-02 11:25:54
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zrn_jane

木虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by gigiloveu at 2012-05-02 11:25:54:
不用固定
我的方法:
收集细胞后 PBS洗2次 加探针(dcf或者dhe) 37度孵育  然后可以选择PBS洗一下或者不洗   然后上流式细胞仪检测  或者用共聚焦显微镜检测

谢谢,已经解决
Theuniqueone
8楼2012-05-11 11:24:26
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