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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 基因敲除问题请教，都是假阳性，根本筛不到突变株
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rfz1989

金虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除问题请教，都是假阳性，根本筛不到突变株

位高手，我目前做空肠弯曲菌缺失株这一块。
我以T载体作为自杀质粒（对空弯而言），构建敲除基因的上下游臂，各1000bp，将其拼接连接到他T载体中，然后电转化导入空肠弯曲菌中，先以T载体上的AMP抗性筛一次同源重组，PCR鉴定以有两条带(野生型，突变性)为阳性，这一步就很多假阳性，好不容易筛到一次同源重组后，在无抗板子上传代筛二次同源重组，传了一代就发现所有菌落都回复了，只有野生型一条带。
做了好长时间了，一直没有进展，大家有没有什么好的建议啊？

一次同源重组
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1楼 2012-07-03 17:28:01
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stue

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你要敲什么基因？你的抗性maker在弯曲菌中可以表达吗？
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2楼2012-09-12 23:21:23
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