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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求解：实时荧光定量PCR奇峰
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)

[交流] 求解：实时荧光定量PCR奇峰 已有8人参与

求高人指点，最近在做定量PCR，阳性扩增曲线很好，可是阴性也有峰型。阴性Ct值在36以上，而且阳性和阴性Ct值相差很大，这样的结果怎么判定？
重复了好几次，阴性都是在36以后起峰，引物、模板都换了，依然是这个结果···
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做自己喜欢的事情，心态决定一切~
1楼 2012-06-20 09:11:38
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xiayongxiu

金虫 (正式写手)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-22 13:36:19
引用回帖:
6楼: Originally posted by 欧朵拉 at 2012-06-20 14:00:31
水没有问题，阳性曲线单峰，而且峰型也很好看，NTC有扩增，可是根据标准，如果在35个循环后还是起峰就判定是阳性，这样明显有问题啊··········...

引物有扩增很正常，可能是引物二聚体，在严格意义上是要重新设计引物的，不过你的阳性很好，单峰，说明引物对于你的目的基因是可以的啊。如果你要弄清楚NTC的扩增是什么，可以拿去测序。一般好的文章，做QPCR，结果都是要拿去测序的。
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一切都要靠自己努力
14楼2012-06-22 10:20:50
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l_h_10

金虫 (小有名气)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-20 15:34:56
你的阴性是没加什么？如果是加了引物，没加模版的话，有可能是引物污染了。（引物是在超净工作台里稀释的吗？）还有你用的是什么的试剂盒？如果是takara的试剂盒的话，也没有关系了，他们试剂盒的本底值比较高，我们也出现过这个问题，就咨询过技术员，takara的技术员说只要在35个循环之后出峰是没有问题的。
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2楼2012-06-20 09:40:02
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xiayongxiu

金虫 (正式写手)
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-20 15:35:05
水也很重要，看看你的水是否有问题。还有就是你的阳性的溶解曲线如何？是单峰还是双峰？如果阳性没有任何问题，而NTC有扩增也是可以的，只要其ct值在35个循环之后。
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一切都要靠自己努力
3楼2012-06-20 11:24:29
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zhaoyonggang

银虫 (小有名气)
★
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我记得阴性阳性ct差7以上就可以忽略了，你的达到这个标准了吗？达到了就不要太纠结于阴性的峰了
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4楼2012-06-20 12:44:38
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