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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RNA条带总是有杂带
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hathaway_

新虫 (初入文坛)

[求助] RNA条带总是有杂带

别人跑的DNA都是仅有拖尾，而我的有两个问题！
1，是在目的条带前面总会有一片杂背景，应该是是小分子的DNA，各位大侠，请教一下，是不是因为我做的是组织，所以没有别人的细胞什么的那么纯粹，总有其他物质干扰？？？？？
2，目的条带不是很直，如图中间总是有点小尾巴，是为什么？有人说是加样时候的问题，可我改进加样后（尽量抬高一点加样，以免枪头损伤了胶孔），还是有一点问题！请教各位！！！
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1楼 2012-06-12 22:54:43
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longrna

新虫 (正式写手)
标题是RNA，里面内容又冒个DNA提取出来...究竟是？
你用什么方法提的？有详细的操作或试剂使用别人才能跟你分析结果啊。
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伟大航线....
2楼2012-06-13 09:25:44
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hathaway_

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by longrna at 2012-06-13 09:25:44
标题是RNA，里面内容又冒个DNA提取出来...究竟是？
你用什么方法提的？有详细的操作或试剂使用别人才能跟你分析结果啊。

题目笔误  呵呵，我用trizol提的RNA,然后反转录成DNA，然后跑条带！
提取过程应该没问题，就是扩增这个体系需要优化，我又跑了梯度PCR，找寻最佳反应体系，试了57，59，60，61，63五个退火温度，试了两个引物浓度，20umol和10umol！
自我感觉60的退火温度目的条带更好一些，而10umol的引物浓度比20的更好些，但还是在100bp的位置靠下面还是有尾巴，请问我还需要再试更低的引物浓度吗？有人说是因为引物浓度过大引起下面的小片段处出现的尾巴！我刚开始做，经验不足，希望高手给分析下可能有的问题！！！
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多多交流
3楼2012-06-15 22:58:13
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涌动的泉

铜虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

第二个问题，应该是电泳槽电压不稳定，或跑胶的缓冲液的问题，建议两个都换一下试试
之前我的凹形的，换了缓冲液后就好了
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我们的过去，成就了如今的我们，无需悔恨
4楼2012-06-16 11:06:50
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mungbean3881

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

也可能是点样量比较多的原因，有时候减少点样量，条带就不会有拖尾
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吃亏未必是祸，占便宜一定不是福
5楼2012-06-16 14:56:10
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longrna

新虫 (正式写手)
是反转录后用cDNA做模板来扩增PCR对吧？
如果PCR产物不特异那就是引物设计方面的问题。可以像你现在这样调整一下退火温度，或再去blast一下。
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伟大航线....
6楼2012-06-17 09:25:33
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