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额敏的雪

金虫 (著名写手)

[求助] NADPH氧化酶的测得

已经测过一次NADPH氧化酶的活性，但是数值没有变化，不知道是哪里出现了问题。实验的时候没有找到具体的操作步骤，只是找了N 篇文献综合总结了一下，想的实践出真知，就大胆的做了，结果失败了。哪位仁兄测过，指点一二。  我参照的实验方法：
    由NADPH氧化酶生成的活性氧产物被检测到，在25度下，SOD抑制的，NADPH依赖的在550nm下细胞色素C的减少。像Heyworth et al （1993）描述那样，反应混合液包括0.1mM的细胞色素C，6.5mMMgCL,87Mmkcl,2.6mMNaCL,8.7mMPipes,Ph 7.3,10pM GTP(y)S,0.16Mmnadph,he10-15pg质膜蛋白，总体积1ml。对照试验包括50pg的SOD来说明在没有活性氧依赖的细胞色素的减少。DPI（at 5 pM），质膜NADPH氧化酶的一种酶激活不可逆抑制剂，抑制激发子激发的NADPH氧化酶的活性。

我遇到的问题：
膜蛋白是高速离心后提取的，应该没有什么问题。测定时加的是150微克。
我遇到的问题是：1，加入SOD和不加sod的对照和处理，及重复之间的吸光值都在0.200-0.215之间，数值之间没有差异。

2，虽然现在实验还没有做出来，但是希望您能把计算的公式也给我一份。
因为我没有找到详细的实验步骤。实验准备的时候我综合了好几个实验版本。下面是我的操作步骤，以便你帮助我找到我错误的地方：1 先加膜蛋白
       2 （将所用的试剂配成混合液，有两份，一份加了SOD,一份没有）加入反应混合液。
       3 加入NADPH启动反应，5min后测定其吸光值。
  我一个处理做了6管，3管加的是有SOD的混合液，另外3管加的是没有SOD的混合液。
其实我也试过加入NADPH后立即测其5min的吸光值，但是在5min的反应过程中，吸光值根本没有变化。加入浓度的NADPH时吸光值有微小的变化。
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额敏的雪

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1楼2012-05-25 09:52:35
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额敏的雪

金虫 (著名写手)
送鲜花一朵
2楼2012-05-25 23:58:39
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额敏的雪

金虫 (著名写手)
3楼2013-01-28 13:02:12
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
额敏的雪: 金币+5 2013-01-29 10:53:05
我以前测植物NADPH氧化酶活性方法如下
Plasma membrane vesicles were isolated from Arabidopsis leaves using two-phase partitioning according to a procedure described previously (Qiu et al., 2002). The membrane vesicles were resuspended in a 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, and used immediately for NADPH oxidase activity assays. A total of 1 μM 16:0-18:2 PA, 16:0-18:2 PC, or lysoPA or 10 μM (±) ABA (final ethanol, 0.02% [v/v]) was applied to the membrane vesicles (3 to 6 μg), respectively, and incubated in the reaction buffer (50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, and 0.5 mm XTT). NADPH (50 μM) was used to initiate the reaction. After 10 min at 25°C, the reaction solution was used for spectrophotometric analysis of XTT formazan production at A470. NADPH activity was expressed as ΔA470 per milligram protein per minute. ΔA470 represents the difference in XTT formazan absorbance at 470 nm in the presence and absence of 100 units of SOD.

Zhang et al. The Plant Cell August 2009 vol. 21 no. 8 2357-2377

Heyworth的方法貌似是测动物细胞的，楼主引用的方法像是谷歌翻译出来的，有仔细看那篇原始文献么？我不确定这个方法是否也适用于植物细胞。
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4楼2013-01-28 19:07:46
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by starseacow at 2013-01-28 19:07:46
我以前测植物NADPH氧化酶活性方法如下
Plasma membrane vesicles were isolated from Arabidopsis leaves using two-phase partitioning according to a procedure described previously (Qiu et al., 2002). The  ...

你好，我也要测植物叶片中NADPH氧化酶活性，没明白这句话是什么意思，你能不能仔细讲一讲啊！ A total of 1 μM 16:0-18:2 PA, 16:0-18:2 PC, or lysoPA or 10 μM (±) ABA (final ethanol, 0.02% ) was applied to the membrane vesicles (3 to 6 μg), respectively, and incubated in the reaction buffer (50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, and 0.5 mm XTT).
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5楼2015-07-11 17:02:40
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