| 查看: 1938 | 回复: 4 | ||||
[求助]
NADPH氧化酶的测得
|
|
已经测过一次NADPH氧化酶的活性，但是数值没有变化，不知道是哪里出现了问题。实验的时候没有找到具体的操作步骤，只是找了N 篇文献综合总结了一下，想的实践出真知，就大胆的做了，结果失败了。哪位仁兄测过，指点一二。 我参照的实验方法： 由NADPH氧化酶生成的活性氧产物被检测到，在25度下，SOD抑制的，NADPH依赖的在550nm下细胞色素C的减少。像Heyworth et al （1993）描述那样，反应混合液包括0.1mM的细胞色素C，6.5mMMgCL,87Mmkcl,2.6mMNaCL,8.7mMPipes,Ph 7.3,10pM GTP(y)S,0.16Mmnadph,he10-15pg质膜蛋白，总体积1ml。对照试验包括50pg的SOD来说明在没有活性氧依赖的细胞色素的减少。DPI（at 5 pM），质膜NADPH氧化酶的一种酶激活不可逆抑制剂，抑制激发子激发的NADPH氧化酶的活性。 我遇到的问题： 膜蛋白是高速离心后提取的，应该没有什么问题。测定时加的是150微克。 我遇到的问题是：1，加入SOD和不加sod的对照和处理，及重复之间的吸光值都在0.200-0.215之间，数值之间没有差异。 2，虽然现在实验还没有做出来，但是希望您能把计算的公式也给我一份。 因为我没有找到详细的实验步骤。实验准备的时候我综合了好几个实验版本。下面是我的操作步骤，以便你帮助我找到我错误的地方：1 先加膜蛋白 2 （将所用的试剂配成混合液，有两份，一份加了SOD,一份没有）加入反应混合液。 3 加入NADPH启动反应，5min后测定其吸光值。 我一个处理做了6管，3管加的是有SOD的混合液，另外3管加的是没有SOD的混合液。 其实我也试过加入NADPH后立即测其5min的吸光值，但是在5min的反应过程中，吸光值根本没有变化。加入浓度的NADPH时吸光值有微小的变化。 |
回复此楼» 本帖已获得的红花（最新10朵）
» 猜你喜欢
感觉普通人已经没办法玩了，躺平是唯一的出路。
已经有26人回复
-
江苏省优青门槛
已经有20人回复
-
植物学论文润色/翻译怎么收费?
已经有175人回复
-
心好累。今年我们部门提交了18个项目。中了11了，可惜我的又挂了
已经有10人回复
-
面上项目计划书
已经有7人回复
-
面上项目计划书附件
已经有9人回复
-
面上项目计划书系统状态
已经有18人回复
-
NSFC-UNEP（与联合国环境规划署）合作项目
已经有33人回复
-
和伊朗人合作
已经有32人回复
-
江苏省自然基金
已经有7人回复
-
生命科学新英文普刊《INVESTIGATION OF LIFE SCIENCE》
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- NADPH该怎么保存？
已经有6人回复
- 辣根过氧化酶过氧化氢传感器
已经有21人回复
- 葡萄糖氧化酶在玻碳电极上直接出峰了？
已经有12人回复
- 葡萄糖氧化酶修饰电极的直接电化学行为
已经有4人回复
- 关于测定笋的多酚氧化酶PPO活性的问题
已经有14人回复
- 无知新手求助，有关肝微粒体，NADPH
已经有3人回复
- NADPH活性的测定
已经有7人回复
- 用葡萄糖氧化酶做循环伏安法时候出不来峰值
已经有38人回复
- 【求助/交流】请问琥珀酸脱氢酶跟琥珀酸氧化酶有什么区别呢？
已经有9人回复
- 【求助/交流】葡萄糖氧化酶酶活的测定方法
已经有17人回复
- 【求助】土壤酶多酚氧化酶活性等的具体测定方法
已经有12人回复
送鲜花一朵
 |
2楼2012-05-25 23:58:39
 |
3楼2013-01-28 13:02:12
starseacow
专家顾问 (职业作家)
-
专家经验: +426 - APEPI: 64
- 应助: 1217 (讲师)
- 金币: 9097.3
- 散金: 16445
- 红花: 226
- 帖子: 4669
- 在线: 2320.2小时
- 虫号: 1136974
- 注册: 2010-11-02
- 性别: GG
- 专业: 植物生理与生化
- 管辖: 动植物
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
额敏的雪: 金币+5 2013-01-29 10:53:05
额敏的雪: 金币+5 2013-01-29 10:53:05
|
我以前测植物NADPH氧化酶活性方法如下 Plasma membrane vesicles were isolated from Arabidopsis leaves using two-phase partitioning according to a procedure described previously (Qiu et al., 2002). The membrane vesicles were resuspended in a 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, and used immediately for NADPH oxidase activity assays. A total of 1 μM 16:0-18:2 PA, 16:0-18:2 PC, or lysoPA or 10 μM (±) ABA (final ethanol, 0.02% [v/v]) was applied to the membrane vesicles (3 to 6 μg), respectively, and incubated in the reaction buffer (50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, and 0.5 mm XTT). NADPH (50 μM) was used to initiate the reaction. After 10 min at 25°C, the reaction solution was used for spectrophotometric analysis of XTT formazan production at A470. NADPH activity was expressed as ΔA470 per milligram protein per minute. ΔA470 represents the difference in XTT formazan absorbance at 470 nm in the presence and absence of 100 units of SOD. Zhang et al. The Plant Cell August 2009 vol. 21 no. 8 2357-2377 Heyworth的方法貌似是测动物细胞的，楼主引用的方法像是谷歌翻译出来的，有仔细看那篇原始文献么？我不确定这个方法是否也适用于植物细胞。 |
4楼2013-01-28 19:07:46
饿的神啊
新虫 (著名写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 5982.7
- 散金: 122
- 帖子: 1004
- 在线: 66.3小时
- 虫号: 2477988
- 注册: 2013-05-23
- 性别: MM
- 专业: 植物病理学
|
你好，我也要测植物叶片中NADPH氧化酶活性，没明白这句话是什么意思，你能不能仔细讲一讲啊！ A total of 1 μM 16:0-18:2 PA, 16:0-18:2 PC, or lysoPA or 10 μM (±) ABA (final ethanol, 0.02% ) was applied to the membrane vesicles (3 to 6 μg), respectively, and incubated in the reaction buffer (50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, and 0.5 mm XTT). |
5楼2015-07-11 17:02:40
