24小时热门版块排行榜    

查看: 1866  |  回复: 10

myitcat

新虫 (初入文坛)

[求助] gataway LR 反应宿主菌选择

现在在用gataway系统构建转基因质粒,LR反应后将全部反应液(10ul)转化进了JM109内,挑取的菌落PCR check 总是显示阴性。
      请问是否JM109不合适?DH5α可以胜任吗?
      目前在用LR clonase ii plus做三片段连接,总是失败,实在不知道还有哪里会有问题,烦请师兄师姐们指点一二
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我们组都是用TOP 10,DH5α也可以,没用过JM109
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
2楼2012-05-17 18:27:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

myitcat

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2012-05-17 18:27:55:
我们组都是用TOP 10,DH5α也可以,没用过JM109

谢谢!
我决定下次分别用TOP 10、DH5α转一下。
3楼2012-05-18 10:49:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mengmenglu

金虫 (小有名气)

我在做LR反应的时候,是转到DH5α的,挑菌摇菌,送测序就是测不出来东西。郁闷的要命,都做了两次转化了。。。
4楼2012-05-19 16:06:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

myitcat

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by mengmenglu at 2012-05-19 16:06:00:
我在做LR反应的时候,是转到DH5α的,挑菌摇菌,送测序就是测不出来东西。郁闷的要命,都做了两次转化了。。。

我已经做了大约八次LR了。
挑的菌落经常提不出质粒。
昨天看了篇文献说LR转化后要选透明菌落,下次你试一下吧。
另外你昨LR用的几种质粒是相同来源吗?
invitrogen的技术支持说如果质粒来源不同,可能会不兼容。
我现在就有3个质粒是别人给的,一个是我自己合成的。
5楼2012-05-22 12:39:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jasco

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

看你的目的载体是什么,一般的载体用DH5a和Top10肯定可以,如果是腺病毒载体质粒(质粒大,较低拷贝)用stbl3比较合适。
6楼2012-05-22 21:05:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mengmenglu

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by myitcat at 2012-05-22 12:39:24:
我已经做了大约八次LR了。
挑的菌落经常提不出质粒。
昨天看了篇文献说LR转化后要选透明菌落,下次你试一下吧。
另外你昨LR用的几种质粒是相同来源吗?
invitrogen的技术支持说如果质粒来源不同,可能会不兼容

昨天发现我的LR酶没有了,昨天定了,要2-3个星期才能到呢。我的质粒是自己构建的入门克隆载体呀,应该没有关系吧。。。
挑菌的时候是所有的都挑了,因为一个板就没有长几个。呵呵,下次啊注意看下透明菌落。谢谢你哈。。
7楼2012-05-23 09:24:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aiweiyiren

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一般作LR反应会转DH5α感受态,转TOP10的话,长斑基本是空载,DH5α长斑基本都是对的,我们公司一直在转DH5α,你也可以试试STBL2.
8楼2012-06-02 22:54:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aiweiyiren

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by mengmenglu at 2012-05-23 09:24:03
昨天发现我的LR酶没有了,昨天定了,要2-3个星期才能到呢。我的质粒是自己构建的入门克隆载体呀,应该没有关系吧。。。
挑菌的时候是所有的都挑了,因为一个板就没有长几个。呵呵,下次啊注意看下透明菌落。谢谢你 ...

你们构建的入门克隆载体的attB和目的载体的相同吗
9楼2012-06-02 22:56:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mengmenglu

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by aiweiyiren at 2012-06-02 22:56:09
你们构建的入门克隆载体的attB和目的载体的相同吗...

相同呀,我又重新买了一只LR酶,做了转化了,今天刚挑菌,明天看看结果怎么样
10楼2012-06-03 17:35:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 myitcat 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 欢迎采矿、地质、岩土、计算机、人工智能等专业的同学报考 +3 pin8023 2026-02-28 5/250 2026-03-02 00:24 by 花YOU重开日
[考研] 一志愿郑大材料学硕298分,求调剂 +5 wsl111 2026-03-01 5/250 2026-03-01 23:45 by 暮雨星晴
[基金申请] 成果系统访问量大,请一小时后再尝试。---NSFC啥时候好哦,已经两天这样了 +4 NSFC2026我来了 2026-02-28 4/200 2026-03-01 22:37 by 铁门栓
[考研] 275求调剂 +3 明远求学 2026-03-01 3/150 2026-03-01 22:29 by 刘兵
[考研] 材料类求调剂 +10 wana_kiko 2026-02-28 12/600 2026-03-01 22:10 by 海嵙Y
[考研] 0805总分292,求调剂 +7 幻想之殇 2026-03-01 7/350 2026-03-01 21:22 by 公瑾逍遥
[考研] 高分子化学与物理调剂 +6 好好好1233 2026-02-28 12/600 2026-03-01 19:48 by 好好好1233
[考研] 306分材料调剂 +4 chuanzhu川烛 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:48 by 无际的草原
[考研] 0856化工专硕求调剂 +12 董boxing 2026-03-01 12/600 2026-03-01 19:45 by 材子momo
[考研] 0856材料求调剂 +11 hyf hyf hyf 2026-02-28 12/600 2026-03-01 18:57 by 18137688336
[考研] 材料学调剂 +9 提神豆沙包 2026-02-28 11/550 2026-03-01 18:15 by ms629
[考研] 290求调剂 +9 材料专硕调剂; 2026-02-28 11/550 2026-03-01 17:21 by sunny81
[考研] 材料工程274求调剂 +3 Lilithan 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:58 by ms629
[考研] 298求调剂 +9 人间唯你是清欢 2026-02-28 12/600 2026-03-01 14:23 by Ducount.Y
[考研] 302材料工程求调剂 +4 Doleres 2026-03-01 5/250 2026-03-01 11:52 by liqiongjy
[考研] 调剂 +3 简木ChuFront 2026-02-28 3/150 2026-03-01 11:46 by 王伟要上岸啊
[考研] 317一志愿华南理工电气工程求调剂 +6 Soliloquy_Q 2026-02-28 11/550 2026-03-01 11:14 by 歌liekkas
[基金申请] 面上模板改不了页边距吧? +5 ieewxg 2026-02-25 6/300 2026-03-01 00:10 by addressing
[考研] 264求调剂 +3 巴拉巴拉根556 2026-02-28 3/150 2026-02-28 21:31 by gaoxiaoniuma
[高分子] 求环氧树脂研发1名 +3 孙xc 2026-02-25 11/550 2026-02-28 16:57 by ichall
信息提示
请填处理意见