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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » gataway LR 反应宿主菌选择
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myitcat

新虫 (初入文坛)

[求助] gataway LR 反应宿主菌选择

现在在用gataway系统构建转基因质粒，LR反应后将全部反应液（10ul）转化进了JM109内，挑取的菌落PCR check 总是显示阴性。
      请问是否JM109不合适？DH5α可以胜任吗？
      目前在用LR clonase ii plus做三片段连接，总是失败，实在不知道还有哪里会有问题，烦请师兄师姐们指点一二
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1楼 2012-05-17 16:57:04
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们组都是用TOP 10，DH5α也可以，没用过JM109
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2012-05-17 18:27:55
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myitcat

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2012-05-17 18:27:55:
我们组都是用TOP 10，DH5α也可以，没用过JM109

谢谢！
我决定下次分别用TOP 10、DH5α转一下。
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3楼2012-05-18 10:49:10
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mengmenglu

金虫 (小有名气)
我在做LR反应的时候，是转到DH5α的，挑菌摇菌，送测序就是测不出来东西。郁闷的要命，都做了两次转化了。。。
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4楼2012-05-19 16:06:00
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myitcat

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mengmenglu at 2012-05-19 16:06:00:
我在做LR反应的时候，是转到DH5α的，挑菌摇菌，送测序就是测不出来东西。郁闷的要命，都做了两次转化了。。。

我已经做了大约八次LR了。
挑的菌落经常提不出质粒。
昨天看了篇文献说LR转化后要选透明菌落，下次你试一下吧。
另外你昨LR用的几种质粒是相同来源吗？
invitrogen的技术支持说如果质粒来源不同，可能会不兼容。
我现在就有3个质粒是别人给的，一个是我自己合成的。
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5楼2012-05-22 12:39:24
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jasco

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

看你的目的载体是什么，一般的载体用DH5a和Top10肯定可以，如果是腺病毒载体质粒（质粒大，较低拷贝）用stbl3比较合适。
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6楼2012-05-22 21:05:37
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mengmenglu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by myitcat at 2012-05-22 12:39:24:
我已经做了大约八次LR了。
挑的菌落经常提不出质粒。
昨天看了篇文献说LR转化后要选透明菌落，下次你试一下吧。
另外你昨LR用的几种质粒是相同来源吗？
invitrogen的技术支持说如果质粒来源不同，可能会不兼容

昨天发现我的LR酶没有了，昨天定了，要2-3个星期才能到呢。我的质粒是自己构建的入门克隆载体呀，应该没有关系吧。。。
挑菌的时候是所有的都挑了，因为一个板就没有长几个。呵呵，下次啊注意看下透明菌落。谢谢你哈。。
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7楼2012-05-23 09:24:03
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aiweiyiren

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一般作LR反应会转DH5α感受态，转TOP10的话，长斑基本是空载，DH5α长斑基本都是对的，我们公司一直在转DH5α，你也可以试试STBL2.
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8楼2012-06-02 22:54:02
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aiweiyiren

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mengmenglu at 2012-05-23 09:24:03
昨天发现我的LR酶没有了，昨天定了，要2-3个星期才能到呢。我的质粒是自己构建的入门克隆载体呀，应该没有关系吧。。。
挑菌的时候是所有的都挑了，因为一个板就没有长几个。呵呵，下次啊注意看下透明菌落。谢谢你 ...

你们构建的入门克隆载体的attB和目的载体的相同吗
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9楼2012-06-02 22:56:09
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mengmenglu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by aiweiyiren at 2012-06-02 22:56:09
你们构建的入门克隆载体的attB和目的载体的相同吗...

相同呀，我又重新买了一只LR酶，做了转化了，今天刚挑菌，明天看看结果怎么样
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10楼2012-06-03 17:35:36
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