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myitcat

新虫 (初入文坛)

[求助] gataway LR 反应宿主菌选择

现在在用gataway系统构建转基因质粒,LR反应后将全部反应液(10ul)转化进了JM109内,挑取的菌落PCR check 总是显示阴性。
      请问是否JM109不合适?DH5α可以胜任吗?
      目前在用LR clonase ii plus做三片段连接,总是失败,实在不知道还有哪里会有问题,烦请师兄师姐们指点一二
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我们组都是用TOP 10,DH5α也可以,没用过JM109
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
2楼2012-05-17 18:27:55
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myitcat

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2012-05-17 18:27:55:
我们组都是用TOP 10,DH5α也可以,没用过JM109

谢谢!
我决定下次分别用TOP 10、DH5α转一下。
3楼2012-05-18 10:49:10
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mengmenglu

金虫 (小有名气)

我在做LR反应的时候,是转到DH5α的,挑菌摇菌,送测序就是测不出来东西。郁闷的要命,都做了两次转化了。。。
4楼2012-05-19 16:06:00
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myitcat

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by mengmenglu at 2012-05-19 16:06:00:
我在做LR反应的时候,是转到DH5α的,挑菌摇菌,送测序就是测不出来东西。郁闷的要命,都做了两次转化了。。。

我已经做了大约八次LR了。
挑的菌落经常提不出质粒。
昨天看了篇文献说LR转化后要选透明菌落,下次你试一下吧。
另外你昨LR用的几种质粒是相同来源吗?
invitrogen的技术支持说如果质粒来源不同,可能会不兼容。
我现在就有3个质粒是别人给的,一个是我自己合成的。
5楼2012-05-22 12:39:24
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jasco

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

看你的目的载体是什么,一般的载体用DH5a和Top10肯定可以,如果是腺病毒载体质粒(质粒大,较低拷贝)用stbl3比较合适。
6楼2012-05-22 21:05:37
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mengmenglu

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by myitcat at 2012-05-22 12:39:24:
我已经做了大约八次LR了。
挑的菌落经常提不出质粒。
昨天看了篇文献说LR转化后要选透明菌落,下次你试一下吧。
另外你昨LR用的几种质粒是相同来源吗?
invitrogen的技术支持说如果质粒来源不同,可能会不兼容

昨天发现我的LR酶没有了,昨天定了,要2-3个星期才能到呢。我的质粒是自己构建的入门克隆载体呀,应该没有关系吧。。。
挑菌的时候是所有的都挑了,因为一个板就没有长几个。呵呵,下次啊注意看下透明菌落。谢谢你哈。。
7楼2012-05-23 09:24:03
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aiweiyiren

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一般作LR反应会转DH5α感受态,转TOP10的话,长斑基本是空载,DH5α长斑基本都是对的,我们公司一直在转DH5α,你也可以试试STBL2.
8楼2012-06-02 22:54:02
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aiweiyiren

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by mengmenglu at 2012-05-23 09:24:03
昨天发现我的LR酶没有了,昨天定了,要2-3个星期才能到呢。我的质粒是自己构建的入门克隆载体呀,应该没有关系吧。。。
挑菌的时候是所有的都挑了,因为一个板就没有长几个。呵呵,下次啊注意看下透明菌落。谢谢你 ...

你们构建的入门克隆载体的attB和目的载体的相同吗
9楼2012-06-02 22:56:09
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mengmenglu

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by aiweiyiren at 2012-06-02 22:56:09
你们构建的入门克隆载体的attB和目的载体的相同吗...

相同呀,我又重新买了一只LR酶,做了转化了,今天刚挑菌,明天看看结果怎么样
10楼2012-06-03 17:35:36
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