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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物及载体/宿主菌选择（用于酶表达）
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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)

[求助] 引物及载体/宿主菌选择（用于酶表达）

本人查到的Alcaligenes faecalis DA1 D-氨基酰化酶序列只有CDS区，为了表达这种酶， 设计引物是不是就没得选择，上游引物只能是从ATG开始的一段序列，下游引物就是终止密码前的一段序列了（用软件看这两段引物得分都很低，目的基因可能不好P）。相应地载体该如何选择，比如怎么判断载体上有没有合适的启动子，我打算就用实验室的PET 30a做表达，宿主菌就用BL21，这样选择有没有什么问题。下面附上了我查到的目的序列，
FEATURES             Location/Qualifiers
     source          1..1455
                     /organism="Alcaligenes faecalis"
                     /mol_type="genomic DNA"
                     /db_xref="taxon:511"
     CDS             1..1455
                     /EC_number="3.5.1.81"
                     /note="DaaAF"
                     /codon_start=1
                     /transl_table=11
                     /product="D-aminoacylase"
                     /protein_id="AAK15530.1"
                     /db_xref="GI:13194736"
                     /translation="MSQPDATPFDYILSGGTVIDGTNAPGRLADVGVRGDRIAAVGDLSASSARRRIDVAGKVVSPGFIDSHTHDDNYLLKHRDMTPKISQGVTTVVTGNCGISLAPLAHANPPAPLDLLDEGGSFRFARFSDYLEALRAAPPAVNAACMVGHSTLRAAVMPDLRREATADEIQAMQALADDALASGAIGISTGAFYPPAAHASTEEIIEVCRPLITHGGVYTHMRDEGEHIVQALEETFRIGRELDVPVVISHHKVMGKLNFGRSKETLALIEAAMASQDVSLDAYPYVAGSTMLKQDRVLLAGRTLITWCKPYPELSGRDLEEIAAERGKSKYDVVPELQPAGAIYFMMDEPDVQRILAFGPTMIGSDGLPHDERPHPRLWGTFPRVLGHYSRDLGLFPLETAVWKMTGLTAAKFGLAERGQVQPGYYADLVVFDPATVADSATFEHPTERAAGIHSVYVNGAAVWEDQSFTGQHAGRVLNRAGA"
ORIGIN      
        1 atgtcccagc ccgacgccac cccgttcgac tacatacttt ccggcggcac cgtcatcgac
      61 ggcacgaacg cgccaggccg gctcgccgac gtgggcgtgc ggggcgatcg gattgccgcc
     121 gtcggcgacc tgagcgccag cagcgcccgc cggcgcatcg acgtggcggg aaaagtggtg
     181 tctccgggct tcatcgactc gcacacgcat gacgacaact acctgctgaa acaccgcgac
      241 atgacgccca agatctcgca gggcgtcacc accgtggtca cgggcaactg cggtatcagt
      301 ctcgccccgc tggcgcacgc caatccgccc gcgccgctgg atctgctgga cgaaggcggc
      361 tcgttccgct ttgcacgctt ctcggactac ctcgaagccc tgcgcgccgc gccgcctgcc
      421 gtcaacgccg cctgcatggt gggccattcc accctgcgcg ccgccgtcat gcccgacttg
      481 cggcgcgaag ccacggccga tgaaatccag gccatgcagg cgctggccga cgatgcgctg
      541 gccagtggcg ccatcggcat ttccacaggc gccttctatc cgcccgccgc ccatgccagc
      601 accgaggaaa tcatcgaagt ctgccgcccc ctgatcacgc atggcggcgt ctacgccacc
      661 catatgcgcg atgagggcga acatatcgtc caggcgctgg aggagacctt ccgcatcggc
      721 cgcgaactgg acgtgccggt cgttatctcg caccacaagg tcatgggcaa gctcaatttc
      781 gggcgctcca aggaaacgct ggccttgatc gaggcggcca tggccagcca ggacgtatcg
      841 ctggacgcct atccctacgt ggcgggctcc accatgctca agcaggaccg cgtcctgctt
      901 gccggccgca cgcttatcac ctggtgcaag ccctatcccg aactgagcgg acgcgacctg
      961 gaagaaatcg ccgccgagcg aggcaagtcc aagtacgacg tggtgcccga actgcagccc
     1021 gccggcgcca tctacttcat gatggacgag cccgacgtgc agcgcatcct ggcgttcggc
     1081 cccaccatga tcgggtccga tggcctgccc cacgacgagc gcccccaccc tcgcctgtgg
     1141 ggaacgtttc cccgggtgct gggccactac tcgcgcgacc tgggcctgtt cccattggag
     1201 accgcggtct ggaaaatgac cggcctgacc gccgccaaat tcggcctggc cgaacggggc
     1261 caggtgcagc ccggctacta cgccgacctg gtggtcttcg acccggccac ggtggcggac
     1321 tcggccacgt tcgagcatcc caccgagcgc gccgcgggca tccattcggt ctacgtcaac
     1381 ggcgcggccg tctgggaaga ccagtcgttc actggccagc atgccggccg cgtcctcaac
     1441 cgggccggag cctga
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1楼 2011-08-12 14:53:48
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
dhd997(金币+2): 2011-08-12 19:18:30
用于克隆的引物经常没有多大的选择余地，得分低没关系，往下做就是了。Primer Prmier 5评分的满分是100分，我7、8分的引物都用过，没有问题。
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飞翔的诗人
2楼2011-08-12 18:16:38
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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-08-12 18:16:38:
用于克隆的引物经常没有多大的选择余地，得分低没关系，往下做就是了。Primer Prmier 5评分的满分是100分，我7、8分的引物都用过，没有问题。

根据上面的目的序列，我要表达出这个酶的话，是不是就只能这么设计引物了，
上游引物：5‘-atgtcccagc ccgacgccac cccgt-3’（atg及其后一段序列）
下游引物：5'-tcagg ctccggcccg gttgaggacg-3'（终止密码子及其上游一段序列）
然后再加上酶切位点和保护碱基，酶切位点，载体和宿主菌该如何选择呢？现有载体pet30a，宿主菌BL21，在载体上选择酶切位点有什么要注意的地方啊？
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3楼2011-08-13 16:33:25
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铅钋锶钇

银虫 (初入文坛)
我的时候Primer Prmier 5设计引物真挺折磨人的，我设计的引物9多呢，可是目的条件也不行，你添加的引物上的酶切位点一定在载体质粒图谱上相符，并且保护碱基尽量是3 个好一些
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4楼2011-08-24 09:40:38
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