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铅钋锶钇

银虫 (初入文坛)

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[求助] 关于野生菌为宿主表达的三亲结合法

我现在在污水中分离出一株枯草芽孢杆菌，我现在想把我分离的外源基因转入此菌中，我看现在网上资源有些做野生菌的表达用的是三亲结合法，就是，供体菌、辅助菌、受体菌三种菌混合培养的一种广法，但是这方面的资源特别的少，我想知道这种方法中用的载体哪种比较好，是用的大肠表达载体、枯草表达载体还是穿梭表达载体。就是除了三亲结合法，之外还有没有好的构建工程菌的方法了。谢谢了，我才来不久金币有些少，请大家多包涵了。

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1楼 2011-08-24 09:29:06

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铅钋锶钇

银虫 (初入文坛)

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1949stone: 沙发就让你自己占了 2011-08-24 20:13:29

лл

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2楼2011-08-24 09:30:28

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天使托

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T.Shen

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【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-24 10:55:30

根据楼主所描述的，应该是三亲株的方法，不知道你是要做什么？我们一般是做敲除用的，当然也有别的用途，所用载体穿梭载体就可以了，不过在协助菌里有一个协助的载体。。。

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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!

3楼2011-08-24 09:56:16

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Petter_JDW

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): good 2011-08-25 07:48:09
铅钋锶钇(金币+10): 2011-08-29 10:28:10

芽孢杆菌属的一般比较难转化得了~我们实验室通常用一下方法~希望能对你有用

①取受体菌接种于BY培养液中，37℃培养到对数生长早中期。此时OD620应在0.4左右，培养时间约为4～5小时。
②将培养后的菌液离心，弃去上清液，再用生长培养基（GM液）洗菌一次，然后将菌体细胞重新悬浮在与BY培养液等体积的GM液中。37℃继续振荡培养到对数生长后期。此时OD620应在0.6～0.9，培养时间约为3～5小时。
③以1:10的比例将GM液中培养的菌液稀释于转化培养基（TM液）中。即取菌液0.2ml加入1.8mlTM液中，在20×150mm的试管中，37℃振荡培养90分钟。
④加入供体质粒，至最终浓度1ug/ml，于20×150mm的试管中，37℃振荡培养30分钟。
⑤取200ul涂布抗性选择平板，37℃培养48小时。
【培养基配方】
A. BY培养基：牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，葡萄糖5g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
B. 1×最低盐溶液：K2HPO4 14g（K2HPO4•3H2O 18.34g），K2HPO4 6g，(NH4)2SO4 2g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7•2H2O）1g，MgSO4•7H2O 0.2g，在蒸馏水中依次溶解，加水至1000ml。
C. L- trp溶液，2mg/ml，贮于棕色瓶内，用黑纸包裹。（过滤灭菌）
D. 生长培养基：GM，使用时混合比例。1×最低盐溶液100ml，1M硫酸镁0.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母汁1ml，L-trp 50ug/ml。
E. 转化培养基：TM，使用时混合比例。1×最低盐溶液100ml，1M硫酸镁0.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.2ml，L-trp 5ug/ml。

其中 50% 葡萄糖过滤灭菌 5%水解酪蛋白和10%酵母汁均可高温灭菌
至于载体你可以试试 pAX01这是一个适用于芽孢杆菌属的过表达载体