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懒蛋铁杆木虫 (著名写手)
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问一些比较低级的问题，部分是胡思乱想的。 情况：外源基因导入感受态细胞，最简单常规的转化方法，不用基因枪啥的直接打进去。 1）外源基因和载体链接，转化Ecoli。为什么非要链接载体？线性的DNA就不能进去了？即使链接到载体上，suoper coiled DNA vector也不是要解链变成线性单链DNA后才进入细胞，另一条留在胞外不是？何苦跟载体连接成那么大的链才进去？ 2）以下四种DNA哪个更容易进入细胞？双链环状，单链环状，双链线性，单链线性. 转化前，ligation之后的DNA 不知道能不能按以上状态存在，就当是假设也行。 3）双链环状超螺旋DNA进入细胞之前据说要解链变成单链线性（网上查的,不知对错），那究竟在什么位点切割成线性？所有质粒都在同一位点么？ 4）有没有以下可能：外源基因和载体没有连上，但而这都被转进细胞了？或者只有其中一个转进细胞了？还表达了如抗性基，lacZ基因等情况？ 5）有没有另一种可能：外源基因与载体一端连接成功，另一端未连上，但却转入细胞了，还表达了各种筛选基因，因而假装阳性克隆滥竽充数的？ 6）线性质粒就不能在细胞中正常存在，复制，转录，遗传吗？非要呈环状吗？ 多谢各位哈~~~尽量给个完整的答案吧，回答部分问题也行，但是我确实想整明白。 50分期，有答必有币~~~追赏！  |
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简单的谈谈我的看法，如有错误，欢迎指正： 1：直接的线性目的基因，本身不能在菌体内表达，基因的表达是需要很多组件的，核糖体结合位点等组件；线性的载体也是可以进到载体中并表达的，如T载体；而且，载体能提供诸如抗性标记、纯化标签、条件诱导等组分，所以说线性还是环形不是表达与否的重点，而是其组成上是不是满足表达要求。 2：转化本身就是使得细菌细胞壁的强度变弱，这样质粒才能进入细菌内部，由此可见，体积较小的形态更容易进入；一般来说，质粒的形态有超螺旋、线性、开环，你说的单链环状是不存在的，不符合质粒特征；连接之后的质粒有可能是上述三种形态。 3：转化时进入的是线性质粒的说法我也听过，可能是因为超螺旋形态体积较大不易进入，只有线性容易进入造成的，而且呈线性不是切割造成的，应该是机械断裂，三种形态在不同的溶剂中含量也是不同的，这也影响了转化的效率。 4：两者没连接上，但是同时转入细菌内部也是可能的，但是，一般来说，目的基因会被迅速水解掉，质粒倒是有可能重新连接，不过总的来说，表达抗性或目的基因的概率不大。 5：与4相似 6：线性质粒也是可以在细胞中正常存在，复制，转录，遗传的，不一定非得是环形，如T载体等。 没经过修饰和处理的线性基因在细菌体内都是不能稳定存在的。 |
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