应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 鱼类线粒体DNA的提取
51/1返回列表
查看: 1512  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

涛涛不绝1988

新虫 (初入文坛)

[求助] 鱼类线粒体DNA的提取 已有1人参与

我最近在做鱼类线粒体DNA的提取，用的常规的碱裂解法提取的，提了7、8次了，但是跑完胶之后除了Maker什么也没有，急啊~ 求高手帮忙分析一下，谢了！
（具体步骤：1、取动物组织2-8g，用SE缓冲夜漂洗，剪碎，加入约30mlSE缓冲液，0℃匀浆,1500rpm 10min,取上清 12000rpm 15min，沉淀物为线粒体，用STM溶液洗一遍。
2、以溶液体积与组织重量0.2ml:1g的STM溶液悬浮线粒体，加DNaseA溶液，（终浓度达到100ug/ml）30℃水浴30min,加EDTA溶液（至终浓度10mmol/L）摇匀，10000rpm 10min，沉淀即线粒体。
3、取部分线粒体用Janus Green B染色并观察线粒体的数目、大小。
4、剩余的线粒体用SE缓冲液洗一遍，然后用4mlSE溶液悬浮纯净线粒体，均分于4支EP管中。
5、12000rpm 10min；弃上清液，每管加150ulTEN溶液，悬浮沉淀，各加入300ul新配制的溶液Ⅴ，混合均匀，冰浴10min；再各加入225ul冷的KAc溶液，冰浴30min。
6、12000rpm 10min，取上清液; 加人与上清液等体积的饱和酚, 轻摇15min; 12000rpm 10min,取上清液; 加人与上清液等体积的氯仿-异戊醇(24 : 1 ) ,充分混合均匀，轻摇15min。12000rpm 10min, 吸取水相。
7、加入1/10体积的3mol/L、PH5.2的醋酸钠，再加入两倍体积无水乙醇，冰浴30min，12000rpm 10min,加入冷的（0℃）70%乙醇溶液洗一次，12000rpm 2min。自然干燥3-4 h或4℃ 冰箱中过夜彻底干燥；加入适量TE完全溶解。
8、加入DNase-free的RNaseA溶液（终浓度200ul/ml），37℃消化60min。重复步骤6和7。
9、取一部分溶液检测mtDNA的纯度和浓度，其余-20℃备用。）
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
Just do
1楼 2012-05-06 12:58:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-08-18 15:16:41
问题可能在于DNAse。抽提过程中线粒体膜破裂，DNase把mtDNA给降解了。线粒体其实不是教科书所说的一粒一粒的，而是空间网状结构，抽提时就有可能线粒体膜破裂了。

能否不用DNase？染色体的DNA很长很大而且结合很多组蛋白，温和裂解细胞后很容易被离心沉淀下来的，而线粒体DNA小的多。所以用常用的RNA抽提办法，就可以抽提出RNA和mtDNA，然后用RNAase降解RNA，剩下的就是mtDNA。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2012-08-18 05:55:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

xiayuling

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你选择的鱼组织最好用鱼的ganzang,这样提取 的线粒体DNA多
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-09 10:14:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

涛涛不绝1988

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiayuling at 2012-05-09 10:14:26
你选择的鱼组织最好用鱼的ganzang,这样提取 的线粒体DNA多

肝脏、精巢、卵巢都试过，效果不理想！
赞一下 回复此楼
Just do
3楼2012-08-17 19:46:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiayuling

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

动物的线粒体DNA很小，不应该用DNase,最后沉淀用无水乙醇，
赞一下 回复此楼
5楼2012-08-18 17:24:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 东华理工大学化材专业26届硕士博士申请 +8 zlingli 2026-03-13 8/400 2026-03-19 16:32 by 轻松不少随
[考研] 271材料工程求调剂 +6 .6lL 2026-03-18 6/300 2026-03-19 15:41 by haoshis
[考研] 304求调剂 +3 曼殊2266 2026-03-18 3/150 2026-03-19 14:42 by peike
[考研] 317求调剂 +3 申子申申 2026-03-19 6/300 2026-03-19 14:16 by 申子申申
[考研] 0703化学调剂 +5 pupcoco 2026-03-17 8/400 2026-03-19 13:58 by houyaoxu
[考研] 一志愿福大288有机化学，求调剂 +3 小木虫200408204 2026-03-18 3/150 2026-03-19 13:31 by houyaoxu
[考研] 0703化学调剂，求各位老师收留 +10 秋有木北 2026-03-14 10/500 2026-03-19 05:52 by anny19840123
[考研] 354求调剂 +4 Tyoumou 2026-03-18 7/350 2026-03-18 21:45 by Tyoumou
[考研] 344求调剂 +6 knight344 2026-03-16 7/350 2026-03-18 20:13 by walc
[考研] 材料专硕306英一数二 +10 z1z2z3879 2026-03-16 13/650 2026-03-18 14:20 by 007_lilei
[考研] 材料，纺织，生物（0856、0710），化学招生啦 +3 Eember. 2026-03-17 9/450 2026-03-18 10:28 by Eember.
[考研] 0703化学336分求调剂 +6 zbzihdhd 2026-03-15 7/350 2026-03-18 09:53 by zhukairuo
[考研] 268求调剂 +6 简单点0 2026-03-17 6/300 2026-03-18 09:04 by 无际的草原
[考研] 考研求调剂 +3 橘颂. 2026-03-17 4/200 2026-03-17 21:43 by 有只狸奴
[硕博家园] 湖北工业大学 生命科学与健康学院-课题组招收2026级食品/生物方向硕士 +3 1喜春8 2026-03-17 5/250 2026-03-17 17:18 by ber川cool子
[考研] 材料工程专硕274一志愿211求调剂 +6 薛云鹏 2026-03-15 6/300 2026-03-17 11:05 by 学员h26Tkc
[考研] 326求调剂 +4 诺贝尔化学奖觊� 2026-03-15 7/350 2026-03-16 17:11 by 诺贝尔化学奖觊�
[考研] 0703 物理化学调剂 +3 我可以上岸的对� 2026-03-13 5/250 2026-03-16 10:50 by 我可以上岸的对�
[考研] 求老师收留调剂 +4 jiang姜66 2026-03-14 5/250 2026-03-15 20:11 by Winj1e
[考研] 070305求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-14 4/200 2026-03-15 11:04 by peike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭