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涛涛不绝1988

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 54
帖子: 8
在线: 8.5小时
虫号: 1287390
注册: 2011-05-06
性别: GG
专业: 男性生殖系统炎症与感染

[求助] 鱼类线粒体DNA的提取已有1人参与

我最近在做鱼类线粒体DNA的提取，用的常规的碱裂解法提取的，提了7、8次了，但是跑完胶之后除了Maker什么也没有，急啊~ 求高手帮忙分析一下，谢了！
（具体步骤：1、取动物组织2-8g，用SE缓冲夜漂洗，剪碎，加入约30mlSE缓冲液，0℃匀浆,1500rpm 10min,取上清 12000rpm 15min，沉淀物为线粒体，用STM溶液洗一遍。
2、以溶液体积与组织重量0.2ml:1g的STM溶液悬浮线粒体，加DNaseA溶液，（终浓度达到100ug/ml）30℃水浴30min,加EDTA溶液（至终浓度10mmol/L）摇匀，10000rpm 10min，沉淀即线粒体。
3、取部分线粒体用Janus Green B染色并观察线粒体的数目、大小。
4、剩余的线粒体用SE缓冲液洗一遍，然后用4mlSE溶液悬浮纯净线粒体，均分于4支EP管中。
5、12000rpm 10min；弃上清液，每管加150ulTEN溶液，悬浮沉淀，各加入300ul新配制的溶液Ⅴ，混合均匀，冰浴10min；再各加入225ul冷的KAc溶液，冰浴30min。
6、12000rpm 10min，取上清液; 加人与上清液等体积的饱和酚, 轻摇15min; 12000rpm 10min,取上清液; 加人与上清液等体积的氯仿-异戊醇(24 : 1 ) ,充分混合均匀，轻摇15min。12000rpm 10min, 吸取水相。
7、加入1/10体积的3mol/L、PH5.2的醋酸钠，再加入两倍体积无水乙醇，冰浴30min，12000rpm 10min,加入冷的（0℃）70%乙醇溶液洗一次，12000rpm 2min。自然干燥3-4 h或4℃ 冰箱中过夜彻底干燥；加入适量TE完全溶解。
8、加入DNase-free的RNaseA溶液（终浓度200ul/ml），37℃消化60min。重复步骤6和7。
9、取一部分溶液检测mtDNA的纯度和浓度，其余-20℃备用。）

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Just do

1楼2012-05-06 12:58:44

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

mitocam

新虫 (正式写手)

应助: 46 (小学生)
金币: 1114.5
散金: 93
红花: 2
帖子: 728
在线: 152.1小时
虫号: 1899939
注册: 2012-07-19
专业: 细胞呼吸与代谢

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-08-18 15:16:41

问题可能在于DNAse。抽提过程中线粒体膜破裂，DNase把mtDNA给降解了。线粒体其实不是教科书所说的一粒一粒的，而是空间网状结构，抽提时就有可能线粒体膜破裂了。

能否不用DNase？染色体的DNA很长很大而且结合很多组蛋白，温和裂解细胞后很容易被离心沉淀下来的，而线粒体DNA小的多。所以用常用的RNA抽提办法，就可以抽提出RNA和mtDNA，然后用RNAase降解RNA，剩下的就是mtDNA。