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涛涛不绝1988新虫 (初入文坛)
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鱼类线粒体DNA的提取 已有1人参与
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我最近在做鱼类线粒体DNA的提取，用的常规的碱裂解法提取的，提了7、8次了，但是跑完胶之后除了Maker什么也没有，急啊~ 求高手帮忙分析一下，谢了！ （具体步骤：1、取动物组织2-8g，用SE缓冲夜漂洗，剪碎，加入约30mlSE缓冲液，0℃匀浆,1500rpm 10min,取上清 12000rpm 15min，沉淀物为线粒体，用STM溶液洗一遍。 2、以溶液体积与组织重量0.2ml:1g的STM溶液悬浮线粒体，加DNaseA溶液，（终浓度达到100ug/ml）30℃水浴30min,加EDTA溶液（至终浓度10mmol/L）摇匀，10000rpm 10min，沉淀即线粒体。 3、取部分线粒体用Janus Green B染色并观察线粒体的数目、大小。 4、剩余的线粒体用SE缓冲液洗一遍，然后用4mlSE溶液悬浮纯净线粒体，均分于4支EP管中。 5、12000rpm 10min；弃上清液，每管加150ulTEN溶液，悬浮沉淀，各加入300ul新配制的溶液Ⅴ，混合均匀，冰浴10min；再各加入225ul冷的KAc溶液，冰浴30min。 6、12000rpm 10min，取上清液; 加人与上清液等体积的饱和酚, 轻摇15min; 12000rpm 10min,取上清液; 加人与上清液等体积的氯仿-异戊醇(24 : 1 ) ,充分混合均匀，轻摇15min。12000rpm 10min, 吸取水相。 7、加入1/10体积的3mol/L、PH5.2的醋酸钠，再加入两倍体积无水乙醇，冰浴30min，12000rpm 10min,加入冷的（0℃）70%乙醇溶液洗一次，12000rpm 2min。自然干燥3-4 h或4℃ 冰箱中过夜彻底干燥；加入适量TE完全溶解。 8、加入DNase-free的RNaseA溶液（终浓度200ul/ml），37℃消化60min。重复步骤6和7。 9、取一部分溶液检测mtDNA的纯度和浓度，其余-20℃备用。） |
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