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majunyang

银虫 (初入文坛)

[交流] 蛋白活性电泳-质谱鉴定 已有2人参与

最近在做非变性活性电泳，遇到些问题不知怎么解决。我的实验步骤如下：
1.电泳：分离胶交联浓度12%，加SDS，与普通变性胶一样，浓缩胶不加SDS，上样缓冲液和电泳缓冲液均不加SDS。冰水混合物中电泳，电压100v.
2.洗去SDS：2.5%Triton X-100 振荡1h.之后pH7.2磷酸盐缓冲液洗3次。
3.反应：50度下 泡在酪蛋白溶液中反应30min.
4.考染脱色
如图：
两种样品，空白区域太大，可能是酶活高，未稀释。
另外，我想拿胶去做质谱鉴定，不知可不可以。酶将酶本身及周围区域的酪蛋白和周围的蛋白（？会不会分解周围原有的蛋白）都分解，显示白色，做个对照不加酪蛋白的对比下，看哪个条带继续存在就是酶的条带，不知对不对？然后去鉴定。
这两张图，貌似也看不出来。还有什么好的办法啊。我就想弄清同工酶的种类。
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.。。。。。。。。。。。
1楼 2012-04-13 08:44:01
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
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两种样品、空白区域是什么意思？

能不能不加SDS？这东西也算是个变性剂。

能不能跑胶结束后贴在平板上显色？
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2012-04-15 18:58:57
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majunyang

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-04-15 18:58:57:
两种样品、空白区域是什么意思？

能不能不加SDS？这东西也算是个变性剂。

能不能跑胶结束后贴在平板上显色？

空白区域是，酶还有活性，把周围的酪蛋白分解而形成的，没被分解的被染成蓝色。恩，我再试一下，不加SDS，切胶用滤纸片在平板上显色。谢谢！
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.。。。。。。。。。。。
3楼2012-04-17 10:42:21
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hn0313

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
最近做的非变性蛋白电泳，12%的分离胶，条带不往下跑而且有的地方脱色脱不掉，后来用8%的分离胶，颜色根本就脱不掉是怎么回事？下面前面是12%时的胶非变性胶，两边的泳道是变性maker，只是用来检测，没有标记作用的；后面的是跑的变性的。而且变性蛋白电泳的条带在非变性中跑不出来。。请专业人士帮忙解决一下。。。非常感谢！！！
蛋白活性电泳-质谱鉴定
Native-PAGE 12% 0415-2.jpg


蛋白活性电泳-质谱鉴定-1
SDS-PAGE 12% 0416-1.JPG
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4楼2014-04-28 13:01:06
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