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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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Pushing2012

超级版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!


[交流] 蛋白表达

最近表达了个蛋白,用的Pet30做载体,目标蛋白41kDa,IPTG诱导后SDS-PAGE检测在36kDa出现明显新的条带,空白菌和表达菌都在41kda有条带,镍柱纯化后得到的蛋白在41kDa,这个让我无法理解,为什么跑胶时新出现的蛋白在36kDa,而纯化出的蛋白在41kDa。 做酶活测试没有活性,请问在做酶活测试时有没有什么注意事项!请高人赐教!
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whb21

兑换贵宾

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Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
这个确实有点诡异,建议你做个ELISA看看表达出来的蛋白是不是你要的,
2楼2012-03-31 10:08:30
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Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
表达的蛋白是在上清吗?
3楼2012-03-31 14:05:00
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sunwei57

实习版主

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Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
全程低温操作,建议重新跑胶检测 你的蛋白
4楼2012-03-31 16:17:16
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churchill87426

主管区长

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Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
LZ的36KDa和41KDa的蛋白位置差别大么?纯化后的蛋白有没有Western检测下是不是目标蛋白?是变性纯化还是Native纯化?纯化过程尽量都在4度操作。
5楼2012-03-31 18:02:57
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rinp

管理员

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Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
打个质谱看看呗,可能降解了?
要是蛋白都符合就甭管了呗~~
6楼2012-03-31 18:31:47
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bbwalkman

版主

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Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
有降解呢?再重新做一次试试呢?
7楼2012-03-31 20:03:32
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Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
大小都不一样肯定不对啊,你的蛋白是否可溶?上清,沉淀,全菌都跑SDS看看吧
8楼2012-03-31 20:51:11
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Pushing2012

版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!


引用回帖:
5楼: Originally posted by churchill87426 at 2012-03-31 18:02:57:
LZ的36KDa和41KDa的蛋白位置差别大么?纯化后的蛋白有没有Western检测下是不是目标蛋白?是变性纯化还是Native纯化?纯化过程尽量都在4度操作。

Native的啊!都是4度操作的
9楼2012-03-31 22:18:00
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Pushing2012

主管区长

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引用回帖:
8楼: Originally posted by guojianping at 2012-03-31 20:51:11:
大小都不一样肯定不对啊,你的蛋白是否可溶?上清,沉淀,全菌都跑SDS看看吧

上清沉淀都有
10楼2012-03-31 22:18:29
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to-be

版主

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Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
1. 预测的蛋白分子量与实际是有差距的。
2.如果确定41KDa是目标蛋白,36KDa蛋白的出现可能是目标蛋白表达不完全(如果标签在N段,可能应该也会挂Ni柱),也可能是些本底表达的杂蛋白,而目标蛋白表达量很低,不明显。
3. 测酶活注意huffer,温度等因素保持活性。如没有活性,要么失活了,要么不是目标蛋白。建议拿诱导的菌液测酶活。
11楼2012-03-31 23:11:42
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Pushing2012

兑换贵宾

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引用回帖:
11楼: Originally posted by to-be at 2012-03-31 23:11:42:
1. 预测的蛋白分子量与实际是有差距的。
2.如果确定41KDa是目标蛋白,36KDa蛋白的出现可能是目标蛋白表达不完全(如果标签在N段,可能应该也会挂Ni柱),也可能是些本底表达的杂蛋白,而目标蛋白表达量很低,不明 ...

分析的很专业,拿菌液测酶活那个蛋白在细胞里 能不能催化我的反应呢?对了 再弱弱的问下 我的底物溶解性不好 用的是DMSO溶解的,这个DMSO会不会影响酶的活性?
12楼2012-04-01 08:49:22
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to-be

主管区长

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!


引用回帖:
12楼: Originally posted by Pushing2012 at 2012-04-01 08:49:22:
分析的很专业,拿菌液测酶活那个蛋白在细胞里 能不能催化我的反应呢?对了 再弱弱的问下 我的底物溶解性不好 用的是DMSO溶解的,这个DMSO会不会影响酶的活性?

1.胞内的蛋白会不会分泌出来,取决于目标蛋白的性质,有没有信号肽等因素。
2.DMSO会不会干扰酶活,作对照就知道了。
15楼2012-04-01 16:59:17
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neu234

版主

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Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
飘过
16楼2012-04-01 17:23:16
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by Pushing2012 at 2012-03-31 22:18:29:
上清沉淀都有

看量,是不是上清中蛋白的条带比较亮?如果是的话就是你的纯化方法问题,纯化出来的不是你的蛋白
17楼2012-04-01 20:41:06
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简单回复
Rosy_yidun13楼
2012-04-01 10:13   回复  
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币-10, 广告 2012-04-01 18:06:42
西瓜: 编辑内容 2012-04-01 18:06
-- [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-1 at 18:06 ]
Rosy_yidun14楼
2012-04-01 10:14   回复  
西瓜: 编辑内容 2012-04-01 18:06
-- [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-1 at 18:06 ]
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