24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 1189  |  回复: 16

Pushing2012

专家顾问

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!


[交流] 蛋白表达

最近表达了个蛋白,用的Pet30做载体,目标蛋白41kDa,IPTG诱导后SDS-PAGE检测在36kDa出现明显新的条带,空白菌和表达菌都在41kda有条带,镍柱纯化后得到的蛋白在41kDa,这个让我无法理解,为什么跑胶时新出现的蛋白在36kDa,而纯化出的蛋白在41kDa。 做酶活测试没有活性,请问在做酶活测试时有没有什么注意事项!请高人赐教!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 抢金币啦!回帖就可以得到:

查看全部散金贴

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

whb21

专家顾问

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!



Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
这个确实有点诡异,建议你做个ELISA看看表达出来的蛋白是不是你要的,
2楼2012-03-31 10:08:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
表达的蛋白是在上清吗?
3楼2012-03-31 14:05:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunwei57

主管区长

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!



Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
全程低温操作,建议重新跑胶检测 你的蛋白
4楼2012-03-31 16:17:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

churchill87426

实习版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!



Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
LZ的36KDa和41KDa的蛋白位置差别大么?纯化后的蛋白有没有Western检测下是不是目标蛋白?是变性纯化还是Native纯化?纯化过程尽量都在4度操作。
5楼2012-03-31 18:02:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rinp

实习版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!



Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
打个质谱看看呗,可能降解了?
要是蛋白都符合就甭管了呗~~
6楼2012-03-31 18:31:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bbwalkman

管理员

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!



Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
有降解呢?再重新做一次试试呢?
7楼2012-03-31 20:03:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
大小都不一样肯定不对啊,你的蛋白是否可溶?上清,沉淀,全菌都跑SDS看看吧
8楼2012-03-31 20:51:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Pushing2012

主管区长

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!


引用回帖:
5楼: Originally posted by churchill87426 at 2012-03-31 18:02:57:
LZ的36KDa和41KDa的蛋白位置差别大么?纯化后的蛋白有没有Western检测下是不是目标蛋白?是变性纯化还是Native纯化?纯化过程尽量都在4度操作。

Native的啊!都是4度操作的
9楼2012-03-31 22:18:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Pushing2012

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!


引用回帖:
8楼: Originally posted by guojianping at 2012-03-31 20:51:11:
大小都不一样肯定不对啊,你的蛋白是否可溶?上清,沉淀,全菌都跑SDS看看吧

上清沉淀都有
10楼2012-03-31 22:18:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

to-be

管理员

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!



Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
1. 预测的蛋白分子量与实际是有差距的。
2.如果确定41KDa是目标蛋白,36KDa蛋白的出现可能是目标蛋白表达不完全(如果标签在N段,可能应该也会挂Ni柱),也可能是些本底表达的杂蛋白,而目标蛋白表达量很低,不明显。
3. 测酶活注意huffer,温度等因素保持活性。如没有活性,要么失活了,要么不是目标蛋白。建议拿诱导的菌液测酶活。
11楼2012-03-31 23:11:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Pushing2012

主管区长

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!


引用回帖:
11楼: Originally posted by to-be at 2012-03-31 23:11:42:
1. 预测的蛋白分子量与实际是有差距的。
2.如果确定41KDa是目标蛋白,36KDa蛋白的出现可能是目标蛋白表达不完全(如果标签在N段,可能应该也会挂Ni柱),也可能是些本底表达的杂蛋白,而目标蛋白表达量很低,不明 ...

分析的很专业,拿菌液测酶活那个蛋白在细胞里 能不能催化我的反应呢?对了 再弱弱的问下 我的底物溶解性不好 用的是DMSO溶解的,这个DMSO会不会影响酶的活性?
12楼2012-04-01 08:49:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

to-be

版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!


引用回帖:
12楼: Originally posted by Pushing2012 at 2012-04-01 08:49:22:
分析的很专业,拿菌液测酶活那个蛋白在细胞里 能不能催化我的反应呢?对了 再弱弱的问下 我的底物溶解性不好 用的是DMSO溶解的,这个DMSO会不会影响酶的活性?

1.胞内的蛋白会不会分泌出来,取决于目标蛋白的性质,有没有信号肽等因素。
2.DMSO会不会干扰酶活,作对照就知道了。
15楼2012-04-01 16:59:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

neu234

管理员

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!



Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
飘过
16楼2012-04-01 17:23:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by Pushing2012 at 2012-03-31 22:18:29:
上清沉淀都有

看量,是不是上清中蛋白的条带比较亮?如果是的话就是你的纯化方法问题,纯化出来的不是你的蛋白
17楼2012-04-01 20:41:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
Rosy_yidun13楼
2012-04-01 10:13   回复  
Pushing2012(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币-10, 广告 2012-04-01 18:06:42
西瓜: 编辑内容 2012-04-01 18:06
-- [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-1 at 18:06 ]
Rosy_yidun14楼
2012-04-01 10:14   回复  
西瓜: 编辑内容 2012-04-01 18:06
-- [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-1 at 18:06 ]
相关版块跳转 我要订阅楼主 Pushing2012 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿西安交大材料学硕(英一数二)347,求调剂到高分子/材料相关专业 +5 zju51 2026-03-31 7/350 2026-04-01 00:47 by fmesaito
[考研] 一志愿西交大080500材料学硕349 +6 jqx1258 2026-03-31 7/350 2026-03-31 21:08 by yuq
[考研] 考研调剂 +9 小蜡新笔 2026-03-29 10/500 2026-03-31 19:52 by Dyhoer
[考研] 0856材料化工调剂 总分330 +17 zhubinhao 2026-03-27 17/850 2026-03-31 18:56 by 小张做实验
[考研] 285求调剂 +3 FZAC123 2026-03-30 3/150 2026-03-31 17:49 by 热情沙漠
[考研] 求调剂 生物学 377分 +6 zzll03 2026-03-31 6/300 2026-03-31 17:33 by 唐沐儿
[考研] 物理学调剂 +4 小羊36 2026-03-30 4/200 2026-03-31 16:16 by lishahe
[考研] 367求调剂 +7 芋泥啵啵… 2026-03-28 7/350 2026-03-31 14:55 by 不吃魚的貓
[考研] 本科211安全工程,初试290分,求调剂 +3 2719846834 2026-03-28 3/150 2026-03-31 13:52 by 热情沙漠
[考研] 276求调剂 +3 赵久华 2026-03-29 3/150 2026-03-31 10:06 by cal0306
[考研] 08工科求调剂286 +5 tgs_001 2026-03-28 5/250 2026-03-31 08:18 by 一只好果子?
[考研] 085601一志愿西北工业大学初试346 +4 085601初试346 2026-03-30 4/200 2026-03-31 07:47 by jp9609
[考研] 303求调剂 +7 DLkz1314. 2026-03-30 7/350 2026-03-30 16:05 by shuang5186
[考研] 0703本科郑州大学求调剂 +7 nhj_ 2026-03-25 7/350 2026-03-30 12:44 by fangnagu
[考研] 283求调剂(080500) +14 A child 2026-03-27 14/700 2026-03-30 12:06 by 探123
[考研] 312,生物学求调剂 +3 小译同学abc 2026-03-28 3/150 2026-03-28 15:32 by 落睿可思
[考研] 086502化学工程342求调剂 +6 阿姨复古不过 2026-03-27 6/300 2026-03-28 07:06 by wangy0907
[考研] 0703化学求调剂,各位老师看看我!!! +5 祁祺祺 2026-03-25 5/250 2026-03-27 21:44 by 东方猪猪
[考研] 求调剂 +4 零八# 2026-03-27 4/200 2026-03-27 18:07 by yu221
[考研] 机械学硕310分,数一英一,一志愿211本科双非找调剂信息 +3 @357 2026-03-25 3/150 2026-03-26 16:34 by by.MENG
信息提示
请填处理意见